大鼠腦內(nèi)功能神經(jīng)元分布的實驗研究

大鼠腦內(nèi)功能神經(jīng)元分布的實驗研究

越來越多的研究表明，網(wǎng)絡系統(tǒng)不是一個唯一的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的雙向關系。然而，是否應該解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某些部位的參與免疫調(diào)節(jié)問題。早期即刻基因被認為是神經(jīng)元激活的標志,c-fos的表達產(chǎn)物包括Fos及其相關蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子,促進靶基因的轉(zhuǎn)錄,在細胞的信號轉(zhuǎn)導中起著重要的作用。外界的多種刺激,包括免疫性刺激均可誘導Fos在中樞的表達。近年來,c-fos誘導及顯示技術在神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)和功能相結合的研究中受到了廣泛的應用。本實驗以脂多糖(LPS)作為免疫激發(fā)劑來模擬免疫激發(fā)狀態(tài),利用免疫組織化學方法顯示并觀察Fos蛋白在腦內(nèi)的分布,為明確與免疫應答相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結構提供一些線索。材料和方法1.飼養(yǎng)環(huán)境成年SD大鼠10只,體重250~350g,安靜、溫暖(20℃)、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)48h。隨機分為實驗組(n=6)和對照組(n=4)。2.試驗組2.1動物的組織固定乙醚吸入麻醉后,經(jīng)腹腔注射300μl生理鹽水溶解的LPS100μg(Sigma,0127∶B8),動物存活3h后用1%戊巴比妥鈉深麻,開胸經(jīng)左心室至升主動脈插管,先以100ml生理鹽水沖洗血液,隨后用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PB,pH7.4)灌流固定。灌畢取全腦置于含30%蔗糖的0.1mol/LPB內(nèi)(4℃)至組織塊沉底。冰凍連續(xù)冠狀切片,片厚30μm。2.2生物素標記-卵白素-hrp混合物面色切片入含0.3%TritonX-100處理后,按ABC法先進行抗Fos免疫組織化學反應。依次孵育于:(1)兔抗Fos抗體稀釋液(1∶3000,SantaCruz)24h(4℃);(2)生物素標記的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)2h(室溫);(3)生物素-卵白素-HRP復合物(ABC,1∶500,Sigma)2h(室溫)。以上每一步驟之后均用PBS液充分漂洗3次,每次10min。最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺法呈色。然后常規(guī)裱片、脫水、透明、DPX封固、光鏡觀察。3.對照組3.1麻醉試驗n.2正常大鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉,3h后戊巴比妥鈉深麻處死,灌流固定取材同前,切片按ABC法進行Fos免疫組織化學染色。3.2生理鹽水比較試驗n.2正常大鼠乙醚吸入麻醉后經(jīng)腹腔注入300μl生理鹽水,存活3h后戊巴比妥鈉深麻處死。切片按ABC法進行Fos免疫組織化學染色。3.3免疫組織化學染色的替代試驗取實驗組大鼠部分大腦切片,用0.01mol/LPBS代替兔抗Fos第一抗體,再按ABC法進行免疫組織化學染色。結果1.試驗組1.1梨狀皮質(zhì)的分布額頂皮質(zhì)和扣帶皮質(zhì)有較密集的Fos陽性分布。梨狀皮質(zhì)(圖1)、外側隔核腹側部、中央杏仁核(圖2)、斜角帶核及終板血管器內(nèi)有中等密度的分布(圖3)。其他皮質(zhì)及核團分布均稀少。1.2腦室旁核和丘腦旁核下丘腦和丘腦區(qū)域Fos陽性產(chǎn)物主要密集分布于下丘腦室旁核(圖4)和丘腦室旁核(圖5),弓狀核、視上核(圖6)、視交叉上核和下丘腦外側區(qū)等有中等密度的分布,外側韁核和正中隆起內(nèi)亦可見到少許Fos表達。1.3腦癱小腦內(nèi)無明顯Fos分布密集區(qū)。1.4延髓腹外側后fos分布中腦導水管周圍灰質(zhì)腹外側部及外側臂旁核內(nèi)有中等密度的Fos陽性分布,腦橋核、上丘、前庭內(nèi)側核和蝸神經(jīng)核內(nèi)也有少量的Fos陽性分布。Fos陽性細胞在延髓的分布極具規(guī)律性,主要密集分布于中、尾段延髓,多為深染,兩側呈對稱性分布。集中分布于延髓背內(nèi)側部(DMM),其次分布于延髓腹外側區(qū)(VLM)及位于兩者之間的中間網(wǎng)狀帶(IRt)內(nèi),三者形成了一條背內(nèi)-腹外方向伸展的弧形帶狀區(qū)——延髓內(nèi)臟帶。Fos陽性細胞在DMM內(nèi)主要分布于弧束核聯(lián)合亞核、內(nèi)側亞核和最后區(qū)(圖7),VLM內(nèi)主要位于腹外側網(wǎng)狀核(圖8),在IRt則主要集中于其內(nèi)側部。此外,三叉神經(jīng)脊束核、外側楔核和下橄欖核等也有少量的Fos分布。上述各部腦區(qū)及核團內(nèi)Fos陽性細胞的分布詳見圖9。2.淺染分布分布2.1麻醉及生理鹽水對照組大鼠腦內(nèi)僅有散在的Fos分布,多為淺染且數(shù)量很少,無明顯密集分布區(qū)。2.2免疫組織化學染色替代實驗的切片反應呈陰性。神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)眾所周知,動物和人體內(nèi)存在著神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡,近10年來,關于神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間關系的研究是目前國內(nèi)外學術界的研究熱點之一。由于此項工作尚處于起步階段,對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與免疫應答的具體部位,仍不甚清楚。LPS是革蘭陰性桿菌的細胞壁成分,能夠刺激免疫細胞分泌白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)等多種細胞因子,在免疫應答研究中常被作為一種多克隆免疫激發(fā)劑來模擬機體免疫激發(fā)狀態(tài)。多數(shù)學者認為LPS引起的和神經(jīng)活動有關的中樞效應主要是由IL-1為主的細胞因子介導的。當機體受到某種刺激(如傷害性刺激、免疫刺激等)時,在該刺激信息向中樞傳導的神經(jīng)通路上,多數(shù)神經(jīng)元均會出現(xiàn)Fos蛋白陽性表達,用免疫組織化學方法可以將其顯示出來。Fos蛋白形態(tài)學顯示方法的建立也為研究免疫刺激信息的傳導通路提供了一個快捷、敏感和方便的研究手段。雖然結果是通過形態(tài)學方法顯示,但在某種程度上反映了一定的功能意義,因此是一種形態(tài)學和功能學相結合的指標。多種刺激均可引起Fos蛋白陽性表達,而且在一定條件下膠質(zhì)細胞也會有反應。但在嚴格控制實驗條件的前提下,Fos顯示方法仍是一種非常方便和分辨率很高的方法。因此,實驗中我們輕柔抓取動物,盡量避免外界非特異性刺激(強光和噪音等),同時采取乙醚誘導麻醉,以防止在給藥過程中動物的掙扎反應,并進行嚴格的對照實驗,保證了結果的特異性。在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的研究中,常將下丘腦作為焦點。Ju等認為下丘腦PVN(特別是其前大細胞亞核)是免疫應答的一個重要整合中樞。經(jīng)側腦室途徑給予LPS,亦可以興奮下丘腦PVN、視上核和邊緣結構等區(qū)域,表現(xiàn)為出現(xiàn)Fos陽性表達。本實驗中我們觀察到腹腔給予LPS主要激活以下腦區(qū):大腦皮層(額頂皮質(zhì))、邊緣前腦(扣帶皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、隔核和杏仁核等)、丘腦和下丘腦、腦干和室周器官(終板血管器、正中隆起、最后區(qū)等),與以往的實驗結果基本一致,說明上述部位與神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)密切相關。1990年饒志仁等研究發(fā)現(xiàn),大鼠延髓中尾段存在一條從背內(nèi)側經(jīng)中間網(wǎng)狀結構至腹外側的弧形帶狀區(qū),與內(nèi)臟活動(心血管、呼吸和胃腸活動等)有密切關系,因此提出了延髓內(nèi)臟帶(medullaryvisceralzone,MVZ)這一新的概念,并已被國際學術界認可。MVZ包括延髓背內(nèi)側的弧束核(NTS)、迷走神經(jīng)背運動核(dmnX)及最后區(qū)(AP)、腹外側的疑核(nA)、外側網(wǎng)狀核(LRt)及腹外側網(wǎng)狀核(VLRt)和兩者之間的中間網(wǎng)狀帶。延髓生命中樞位于MVZ內(nèi)。值得注意的是,實驗結果顯示MVZ內(nèi)對LPS免疫刺激起反應的神經(jīng)元主要位于其內(nèi)側部,說明MVZ內(nèi)側部與神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的調(diào)控相關。MVZ作為一獨特的機能結構區(qū),有著復雜而重要的功能。它是內(nèi)臟感覺傳遞中繼站,參與軀體-內(nèi)臟感覺的會聚。MVZ與前腦邊緣系(中央杏仁核、終紋床核等)、下丘腦和丘腦等之間存在直接的往返環(huán)路和通過外側臂旁核和中腦中央灰質(zhì)的間接環(huán)路,這些傳導通路可能與免疫反應的調(diào)控有關。本文圖1~8見插圖第2頁圖版說明圖1大腦梨狀皮質(zhì)內(nèi)Fos陽性細胞×40圖2中央杏仁核內(nèi)Fos陽性細胞×80圖3斜角帶核(DB)及終板血管器(VOLT)內(nèi)Fos陽性細胞×80圖4下丘腦室旁核內(nèi)Fos陽性細胞×80圖5丘腦室旁核(PV)內(nèi)Fos陽性細胞×40圖6視上核內(nèi)Fos陽性細胞×40圖7延髓內(nèi)臟帶(MVZ)背內(nèi)側部(DMM)內(nèi)Fos陽性細胞(AP.最后區(qū),NTS.孤束核)×40圖8MVZ腹外側部(VLM)內(nèi)Fos陽性細胞×40ExplanationoffiguresFig.1Fospositiveneuronsinthepiriformcortex.×40Fig.2Fospositiveneuronsinthecentralamygdaloidnucleus.×80Fig.3Fospositiveneuronsinthediagonalbandnucleus(DB)andvascularorganoflaminaterm(VOLT).×80Fig.4Fospositiveneuronsinthehypothalamicparaventricularnucleus.×80Fig.5Fospositiveneuronsintheparaventricularthalamicnucleus(PV).×40Fig.6Fospositiveneuronsinthesupraopticnucleus.×40Fig.7Fosposi