固定化酶的研究進(jìn)展

固定化酶的研究進(jìn)展

酶固定是一種將活動(dòng)酶束縛或限制在特定范圍內(nèi)的新技術(shù)，但它仍然可以提供特定的酶誘反應(yīng)，并重復(fù)使用。與水溶酶相比,固定化酶在保持其高效、專一、溫和及酶的活性可調(diào)節(jié)控制等酶催化反應(yīng)特性以外,還有分離回收容易、可重復(fù)多次使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡(jiǎn)便等系列優(yōu)點(diǎn),因此在生物及生物工程、醫(yī)藥、食品、醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域得以迅速發(fā)展。經(jīng)過(guò)幾十年的研究和發(fā)展,固定化酶技術(shù)已取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,在傳統(tǒng)固定化酶方法的基礎(chǔ)上,著力研究性能優(yōu)異的載體材料,已成為固定化酶技術(shù)目前最為活躍的研究方向之一。本文對(duì)近幾年來(lái)固定化酶載體的制備及固定化酶的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。1固定化酶載體的研究1.1葡萄糖氧化酶的分離和固定殼聚糖(Chitosan)是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物,是一種氨基多糖。由于殼聚糖具有良好的機(jī)械性能、穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì),同時(shí)又易于接枝而改性,再加上其來(lái)源豐富,成本低廉,制備簡(jiǎn)單,已成為開(kāi)發(fā)固定化酶載體材料的方法之一。利用殼聚糖上的氨基與戊二醛發(fā)生Schiff反應(yīng),再與酶形成Schiff堿而固定化酶。以甲殼胺與羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸的兩種氫鍵復(fù)合物為載體固定葡萄糖氧化酶(GOD)和纖維素酶。并用透射電鏡觀察了其結(jié)構(gòu),整個(gè)復(fù)合物固定化酶分子呈纖維狀,且微結(jié)構(gòu)中有供酶存在的空間。最近,在室溫下采用溶液-凝膠法聚合制得了殼聚糖—SiO2混合物,用于固定葡萄糖氧化酶,在pH=5.6時(shí),酶活最高,為1585U/g。30℃下保存10d后,酶活力仍保持86%,而游離酶在同樣條件下5d已失活。EhabTaqieddin等報(bào)道了生物相容性的硅藻鹽和殼聚糖核殼型復(fù)合載體,將β—半乳糖酶固定在硅藻鹽上,催化對(duì)硝基苯酚的合成,殼聚糖殼起著漉網(wǎng)的作用,限制著底物和產(chǎn)物的進(jìn)出。此外,其他類天然高分子,經(jīng)改性也可用作固定化酶的載體。1.2合成高合金載體的研究1.2.1研究對(duì)象的確定自Chen等將聚碳酸乙烯撐脂(PVCA)用雙端氨基環(huán)醚和乙醇氨進(jìn)行交聯(lián)制備酶載體后,聚碳酸乙烯撐脂(PVCA)載體也得到了較好的研究。黃家賢工作組將先合成具有良好生物組織相容性、不易降解且易于由腎臟排出的α、ω—雙端氨基聚乙醇(H2N—PEG—NH2),再與PCVA進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng),得親水性顯著改善的球狀載體,載體與胰蛋白酶進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)制備了固定化胰蛋白酶,當(dāng)ω(PVCA)/ω(H2N—PEG—NH2)為0.5時(shí),酶蛋白的比活及其與載體的結(jié)合量均到達(dá)最高值。1.2.2新型固定化酶通過(guò)自由基沉淀聚合反應(yīng)合成甲基丙烯酸—丙稀酰胺—順丁烯二元酸酐三元共聚物,利用共聚物上的酸酐基團(tuán),直接進(jìn)行木瓜蛋白酶的固定化。這種固定化酶可通過(guò)調(diào)節(jié)體系的pH值來(lái)改變其沉淀-溶解狀態(tài)。研究表明,共聚物組成不同,轉(zhuǎn)變的臨界pH值也不同(pH=2~4),這樣就得到具有游離酶和固定酶兩者優(yōu)點(diǎn)的新型固定化酶制劑。甲基丙烯酸縮水甘油酯—N,N′—亞甲基雙(丙烯酰胺)共聚物載體固定青霉素?；?可得到高活性的生物催化劑。TahsinBahar等報(bào)道了用懸浮聚合法合成聚甲基丙烯酸羥丙酯/甲基丙烯酸水凝膠顆粒,以此為載體共價(jià)固定α—胰凝乳蛋白酶。最優(yōu)條件下固定化酶與游離酶相比,熱穩(wěn)定性顯著提高,且KM常數(shù)是游離酶的2倍多。用懸浮聚合法合成聚乙烯二甲基丙烯酸乙二醇酯/二乙氧基甲基丙烯酯P(EGDMA/HEMA)非多孔微球,以此為載體固定尿素酶。選用含有活性環(huán)氧基團(tuán)的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和親水的N—乙烯吡咯烷酮(NVP)兩種單體,以N,N—亞甲基雙丙稀酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑,通過(guò)反相懸浮聚合合成了親水性大孔GMA—NVP—MBAA三元聚合物載體(GNM)。將巨大芽孢桿菌青霉素?；腹矁r(jià)偶聯(lián)在平均孔徑為16.5nm的GNM載體上,制成固定化?；?其表觀活性高達(dá)625U/g。該固定化酶在4℃可保存40d,且可多次使用。1.2.3固定化脂肪酶載體的應(yīng)用根據(jù)水溶性大分子間可通過(guò)次級(jí)鍵合力如氫鍵、靜電力和疏水相互作用等形成水不溶性大分子復(fù)合物沉淀的性質(zhì),研究了利用這種大分子復(fù)合物作為酶的載體,得到沉淀—溶解性可調(diào)節(jié)的固定化酶載體。如在二乙烯基苯交聯(lián)下,丙烯酸胺(AM)、丙烯腈(AN)的摩爾比為1∶3時(shí),在65℃經(jīng)懸浮聚合24h所得三元共聚物,以其為載體對(duì)牛血清白蛋白有最大結(jié)合量209.3mg/g(干)。通過(guò)其它的方法可以得到不同的載體材料,如以AOT(二(2—乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉)/正庚烷/水/明膠組成的反相微乳凝膠可作為脂肪酶的固定化載體。在室溫下,固定化脂肪酶催化棕櫚酸和十六醇的酯化反應(yīng),固定化脂肪酶可重復(fù)使用16次,平衡轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)90%。由鄰苯二酚和4,4′—亞甲基苯胺合成了一種新的功能聚合物,芳香胺—鄰醌聚合物。聚合物獨(dú)特的納米微觀顆粒和孔穴結(jié)構(gòu),使其成為吸附法固定化酶的良好載體。以N—異丙基丙烯酰胺等合成了溫敏型載體聚N—異丙基丙烯酰胺(NIP)及其衍生物,采用該類載體代替?zhèn)鹘y(tǒng)載體,可在37℃的生理溫度下進(jìn)行反應(yīng),進(jìn)一步提高了免疫分析反應(yīng)的速度和效率。1.3固定化乳酸酶的制備磁性高分子微球是內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物(如鐵、鈷、鎳及其氧化物)的超細(xì)粉末而有磁響應(yīng)性的高分子微球,其制備方法有包埋法、共沉淀法、單體聚合及化學(xué)轉(zhuǎn)化法。如利用噴霧干燥法制得粒徑分布在1.0~1.5μm之間,磁含量約為15%的聚苯烯腈的磁性微球,作為固定化酶的載體。他們也制備了表面功能化磁性微球,固定化乳酸酶,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示固定化酶的量與磁性微球的量成正比。此外,用等離子體等高能物理方法也可制得性能優(yōu)異的載體材料。1.4氯化生物催化劑無(wú)機(jī)硅藻土或多孔玻璃比有機(jī)載體更耐微生物降解、更高熱穩(wěn)定性和更低的價(jià)格,也受到固定化酶工作者的重視。通過(guò)烷基胺與對(duì)甲基苯甲酸反應(yīng),直接生成芳胺的衍生物,比常用方法縮短了一步。然后用重氮化法固定木蛋白酶,酶量為240mmg/g載體。用這種方法合成的載體固定化酶,其對(duì)熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性及產(chǎn)率都比較理想。在溫和條件下,將氯化過(guò)氧化酶共價(jià)固定在功能化硅膠上,制成了氯化生物催化劑,該酶催化劑與游離酶相比,表現(xiàn)出良好的催化性,且固定化酶的穩(wěn)定性不受pH值和氧化劑濃度的影響。共價(jià)法將α—淀粉酶固定在粒徑為0.5~10μm的硅膠顆粒上,在低于淀粉凝膠化溫度下水解24h,可使?jié)舛葹?00mg/mL淀粉溶液90%的發(fā)生水解。值得一提的是,有文獻(xiàn)報(bào)道將檸檬酸裂解酶等固定在傳質(zhì)交互式媒介單片載體上,為固定化酶載體的研制開(kāi)發(fā)提供了新的思路。2載體類型及其所帶化合物的確定根據(jù)酶的性質(zhì)及其用途,酶的固定方法一般有包埋法,交聯(lián)法、吸附法、共價(jià)結(jié)合法,此外,還有物理吸附。理想的載體除應(yīng)具備符合操作需要的形狀、粒度和機(jī)械強(qiáng)度,同時(shí)其表面還應(yīng)具有一定數(shù)量的與酶結(jié)構(gòu)及固定方法相匹配的官能團(tuán)。如:-OH、-COO-和-NH2等。表1中列出了載體類型及其所帶基團(tuán)和酶的固定方法。酶固定化后與游離酶相比,固定化酶的穩(wěn)定性(如pH、溫度、半衰期)有了較大的提高,這擴(kuò)大了酶的使用范圍,顯示了固定化技術(shù)在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的潛在價(jià)值。3固體化酶的應(yīng)用3.1pcp反應(yīng)產(chǎn)物的活性生物傳感器是由生物活性物質(zhì)與換能器組成的分析系統(tǒng),能簡(jiǎn)便的測(cè)定各種特異性很強(qiáng)的物質(zhì),在臨床檢測(cè)、工業(yè)檢測(cè)等方面得以廣泛應(yīng)用。固定化膽固醇氧化酶裝管與氧傳感器,溶氧儀構(gòu)成的液流型傳感器,膽固醇檢出限為5mg/L。采用溶膠凝膠法制備的固定化葡萄糖酶柱,并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光型的葡萄糖傳感器,可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的在線測(cè)定。線性范圍為3.5~70mol/L,相關(guān)系數(shù)為0.999,檢出限為0.6mol/L。陰離子聚合物鋨—聚乙烯吡咯(PVP—OS)與辣根過(guò)氧化酶(HRP)基于靜電相互作用而組裝的多層膜電極,酶電極的響應(yīng)迅速,使用方便。通過(guò)聚賴氨酸修飾將微過(guò)氧化物酶—11(MP—11)固定在金電極表面,制成MP—11修飾電極。該修飾電極對(duì)氧的還原具有電催化活性。固定化酶在化學(xué)及化工領(lǐng)域中的應(yīng)用研究引起了人們的廣泛興趣。固定化脂肪酶能合成具有解毒鎮(zhèn)痛、消炎抗風(fēng)濕藥物(S)—(+)—布洛芬豬胰脂酸酶在有機(jī)相中催化丁酸甲酯和正丁醇的酯交換反應(yīng),效果也十分理想。蛋白酶固定化后也可用于肽鍵合成及有機(jī)化合物酶促反應(yīng)。殼聚糖固定化胰蛋白酶制備具有多種藥用價(jià)值的高比活性抑肽酶已顯示出工業(yè)應(yīng)用前景。米曲氨基?；覆鸱諨,L—丙氨酸得到光學(xué)純的D型丙氨酸,能有效緩解醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)對(duì)其的需求壓力。隨著環(huán)境污染日趨嚴(yán)重,固定化酶在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾饔谩Ｄz包埋辣根酸過(guò)氧化物酶能有效催化氧化去除水溶液中的酚,對(duì)混合酚的處理,存在明顯的協(xié)同作用。固定化乙酰膽堿酯酶(AchE)對(duì)有機(jī)磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒具有較高的檢測(cè)靈敏度,可用于食品、環(huán)境等領(lǐng)域中微量有機(jī)磷化合物的檢測(cè)。3.2酶分析檢測(cè)系統(tǒng)固定化酶反應(yīng)器(ImmobilizedenzymereactorIMER)可以與HPLC或FIA的檢測(cè)器構(gòu)成分析檢測(cè)系統(tǒng),擴(kuò)大了酶分析的應(yīng)用范圍。3.2.1充填式固定化酶imer-pcr的激活國(guó)內(nèi)學(xué)者建立了高效液相色譜分離—柱后固定化酶反應(yīng)器—電化學(xué)檢測(cè)法,用于檢測(cè)乙酰膽堿ACh和Ch的含量。在0.2~100mol/L范圍內(nèi)ACh和Ch的濃度與其響度的線性關(guān)系良好,它們的檢測(cè)限都達(dá)50fmol。用處理過(guò)的多孔玻璃珠(CPG)—10(80—100目)偶聯(lián)膽甾醇氧化酶,制得的填充式反應(yīng)器用于HPLC,檢測(cè)膽甾醇,靈敏度提高3.4~4.4倍。激活后的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑Partisil-10SCX吸附葡萄糖氧化酶制成的IMER,用于HPLC,測(cè)定血清與全血中的葡萄糖含量,使用一月后對(duì)葡萄糖的響度值仍可達(dá)最初響度值的95%,且無(wú)需低溫保存。此外,用戊二醛激活的大孔硅膠再共價(jià)固定甘油醇—3—磷酸脫氫酶(GAPDH),然后裝入色譜柱中制成填充式固定化酶反應(yīng)器(GAPDH-IMER),用于液相色譜和在線色譜檢測(cè)系統(tǒng)中。該反應(yīng)器可在線檢測(cè)各種寄生疾病,并在毒品檢測(cè)中有潛在的應(yīng)用意義。3.2.2乳酸脫氫酶偶聯(lián)與檢測(cè)采用FIA-IMER—化學(xué)發(fā)光法測(cè)定人血清中酸含量,線性范圍為400~1000mg/mL,檢測(cè)下限16mg/mL,且固定化酶柱可重復(fù)使用至少700次以上。將乳酸脫氫酶偶聯(lián)在CPG上,用于FIA測(cè)定人體液中L—乳酸,線性范圍在0.1~4.4mmol/L,檢測(cè)限為0.4mmol。采用固定化酶管安培法結(jié)合FIA能快速的測(cè)定青霉素的含量,結(jié)果受測(cè)定條件的影響小,精密度高,且酶管中青霉素酶的活力穩(wěn)定。3.2.3aldi-tof聯(lián)用技術(shù)IMER與基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF,MS)聯(lián)用技術(shù)用于蛋白質(zhì)的肽譜分析。該法尤適用于高靈敏