hogg1基因多態(tài)性和血8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤水平與急性心肌梗死的相關(guān)性研究

hogg1基因多態(tài)性和血8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤水平與急性心肌梗死的相關(guān)性研究

在二甲基氧化損傷中，脫氧核糖（8-hydrolydeoxygnatico，8-hydg）是最具代表性的損傷產(chǎn)物。它是評(píng)價(jià)氧氣和d氧化損傷的一般生物指標(biāo)。人類(lèi)8-羥基鳥(niǎo)嘌呤糖苷酶(human8-hydroxyguanineglycosylase,hOGG1)是一種DNA修復(fù)酶,可以對(duì)損傷了的DNA進(jìn)行修復(fù),是8-OHdG特異的切除修復(fù)酶。研究表明hOGG1基因第7外顯子第1245位堿基的C/G多態(tài),使326位密碼子或編碼絲氨酸(Ser)或編碼半胱氨酸(Cys),表現(xiàn)出不同的酶活性,可能與個(gè)體的氧化損傷相關(guān)。筆者研究hOGG1基因Ser326Cys多態(tài)性和血清8-OHdG水平與急性心肌梗死(AMI)的關(guān)系,從而探討AMI的遺傳易感性和氧化應(yīng)激機(jī)制在AMI發(fā)病中的作用。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例選擇選擇標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)用病例-對(duì)照的研究方法,連續(xù)入選2009年1月至2011年6月間在本院住院的祖籍為新鄉(xiāng)地區(qū)的患者。其中確診為AMI者300例(男158例,女142例)作為病例組。入選標(biāo)準(zhǔn):均符合2002年AHA/ACC關(guān)于AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn):①持續(xù)胸痛20min以上;②常規(guī)12導(dǎo)聯(lián)心電圖至少相鄰兩個(gè)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高(胸導(dǎo)聯(lián)≥0.2mV、肢體導(dǎo)聯(lián)≥0.1mV),或無(wú)導(dǎo)聯(lián)ST抬高但至少有相鄰兩個(gè)導(dǎo)聯(lián)發(fā)生持續(xù)ST段壓低≥0.1mV,或有對(duì)稱性T波倒置及心電圖有動(dòng)態(tài)改變;③血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平升高超過(guò)正常值水平上限2倍以上或肌鈣蛋白T(cTnT)>0.1ng/ml。排除:①年齡小于30歲,大于75歲;②合并心臟瓣膜病、心肌病和嚴(yán)重心力衰竭[左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<0.35];③近期接受過(guò)抗氧化治療者;④糖尿病合并視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)病變者;⑤精神心理性疾病患者;⑥腫瘤、急慢性炎癥、肝腎疾病、自身免疫性疾病者;⑦近期有大創(chuàng)傷或者經(jīng)歷大手術(shù)者。對(duì)照按1:1配對(duì)原則,選擇居住于當(dāng)?shù)?、同性別、年齡相差5歲以內(nèi)的同期住院的冠心病疑似人群,共300例作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn):冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)冠狀動(dòng)脈未見(jiàn)病變者。排除標(biāo)準(zhǔn)同上。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并征得所有入選對(duì)象知情同意,所有研究對(duì)象均無(wú)親緣關(guān)系,均填寫(xiě)知情同意書(shū)。1.2生化指標(biāo)檢測(cè)記錄所有入選對(duì)象的一般資料包括年齡、性別、體重,測(cè)量血壓(休息狀態(tài)下,非同日上午三次測(cè)量血壓,取其平均值),計(jì)算體重指數(shù),詢問(wèn)有無(wú)高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒、高血脂等。所入選者取血前24h禁酒及高脂飲食,空腹12h后取肘靜脈非抗凝血6ml,抽血后lh內(nèi)以3000rpm離心20min,分離血清,一部分直接用全自動(dòng)生化分析儀(日立公司,日本)測(cè)定生化指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FBG),一部分置于-20°C冰箱中待測(cè)8-OHdG。人血清8-OHdG測(cè)定采用ELISA法,按試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Trevigen公司)說(shuō)明書(shū)操作。1.3pcr檢測(cè)細(xì)胞中人體內(nèi)細(xì)胞的表達(dá)應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)hOGG1基因多態(tài)性。抽取入選者外周靜脈血2ml置入EDTA抗凝管,用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天維時(shí)代科技有限公司)提取白細(xì)胞DNA,置于-20℃冰箱保存。引物為5′-GGAAGGTGCTTGGGGAAT-3′和5′-ACTGTCACTAGTCTCACCAG-3′。反應(yīng)在MJPTC-220PCR儀(M.J.Research公司)進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25μl,按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增:94℃預(yù)變性3min,然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min。所有的PCR產(chǎn)物用Fnu4HI內(nèi)切酶(Fermentas公司)37℃消化12h,3%瓊脂糖凝膠(含0.5mg/L溴化乙啶)電泳1h后,用紫外分析儀觀察結(jié)果。1.4比較方法及樣本采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,定量資料以xˉ±sxˉ±s表示,定性資料用百分比表示。組間頻率比較用χ2檢驗(yàn),組間連續(xù)變量比較采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。應(yīng)用多因素Logistic回歸分析來(lái)控制各混雜因素的影響,判讀基因型后,計(jì)算各組基因型頻率及等位基因頻率,以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),確認(rèn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡,計(jì)算OR及95%CI以進(jìn)行危險(xiǎn)度評(píng)價(jià),分析比較病例組hOGG1各基因型8-OHdG、血脂和血糖水平,以P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1cd水平和糖尿病和吸煙例數(shù)與對(duì)照組比較,病例組8-OHdG、FBG和LDL-C水平及糖尿病和吸煙例數(shù)明顯增高(P均<0.05)。性別、年齡、血壓、體重指數(shù)、TC、TG、HDL-C及飲酒例數(shù)兩組無(wú)差異(P均>0.05)(表1)。2.2bp片段基因型hOGG1基因擴(kuò)增目的片段大小為200bp。經(jīng)酶切后有3種基因型:僅有200bp片段為Ser/Ser基因型,即野生型純合子,既有200bp片段,又有100bp片段為Ser/Cys基因型,即雜合子;僅有100bp片段為Cys/Cys基因型,即變異型純合子,相應(yīng)地產(chǎn)生3種不同的電泳條帶(圖1)。2.3cys基因型的危險(xiǎn)因素分析兩種等位基因頻率分布無(wú)差異(P=0.16),三種基因型頻率分布差異有顯著性(P=0.001),病例組Cys/Cys基因型頻率明顯高于對(duì)照組,Ser/Cys基因型頻率明顯低于對(duì)照組,二者比較差異有顯著性(P=0.001)。進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:①相對(duì)于Ser/Cys基因型,攜帶Cys/Cys和Ser/Ser基因型者發(fā)生AMI的危險(xiǎn)性均增加(OR1=2.12,95%CI:1.38～3.25和OR=1.55,95%CI:1.08～2.24),經(jīng)校正8-OHdG、FBG、LDL-C水平和糖尿病、吸煙例數(shù)等混雜因素后,提示:Cys/Cys基因型是發(fā)生AMI的危險(xiǎn)因素(OR2=1.97,95%CI:1.17～2.48),Ser/Ser基因型的作用不明顯(OR2=1.35,95%CI:1.01～2.00),可推測(cè)Ser/Cys基因型可能是一種保護(hù)性因素。②因Ser/Ser基因型的作用不明顯,筆者將Ser/Ser和Ser/Cys基因型合并計(jì)算,發(fā)現(xiàn)攜帶Cys/Cys基因型者患心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR1=1.75,95%CI:1.18～2.59),經(jīng)校正后,提示Cys/Cys基因型可能是AMI的危險(xiǎn)因素(OR2=1.99,95%CI:1.20～2.69)(表2)。2.4cys基因型的檢測(cè)病例組hOGG1各基因型比較,Cys/Cys基因型的8-OHdG、FBG和LDL-C水平明顯高于Ser/Ser+Ser/Cys基因型(P<0.05)(表3)。3cys基因型與ami相關(guān)性研究最近的研究發(fā)現(xiàn)hOGGl低表達(dá)細(xì)胞其DNA修復(fù)能力降低。對(duì)于hOGGl基因,目前主要研究第7外顯子的Ser326Cys多態(tài)性與腫瘤易感性的關(guān)系,且多數(shù)學(xué)者認(rèn)為hOGGl的表達(dá)與其多態(tài)性相關(guān),hOGGlCys326的修復(fù)能力低于hOGGlSer326,攜帶Cys/Cys基因型的人群患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)比較高,并且可能與其他環(huán)境因素及生活習(xí)慣聯(lián)合作用影響癌癥的發(fā)病。筆者的研究發(fā)現(xiàn),AMI患者Cys/Cys基因型頻率明顯高于正常對(duì)照組,Ser/Cys基因型頻率明顯低于對(duì)照組,兩種基因型比較差異有顯著性(P=0.001),相對(duì)于Ser/Cys基因型,攜帶Cys/Cys和Ser/Ser基因型者發(fā)生AMI的危險(xiǎn)性均增加,經(jīng)校正混雜因素后,發(fā)現(xiàn)Cys/Cys基因型是發(fā)生AMI的危險(xiǎn)因素,而Ser/Ser基因型的作用不明顯,可推測(cè)Ser/Cys基因型可能是一種保護(hù)性因素。根據(jù)上述研究觀點(diǎn)可以推測(cè),攜帶Cys/Cys基因型者,其DNA修復(fù)能力降低,而攜帶Ser/Cys基因型者,其DNA修復(fù)能力可能提高,說(shuō)明Cys/Cys基因型可能是AMI的危險(xiǎn)因素,而Ser/Cys可能是一致保護(hù)性基因型。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Cys等位基因的修復(fù)能力比Ser等位基因低約7倍。筆者將Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型合并計(jì)算,發(fā)現(xiàn)攜帶Cys/Cys基因型者患AMI的風(fēng)險(xiǎn)增加約2倍。表明攜帶Ser等位基因者,修復(fù)能力較高,從心血管領(lǐng)域證明了該基因多態(tài)性的作用,這與上述體外實(shí)驗(yàn)觀點(diǎn)基本一致,說(shuō)明了hOGGlSer326Cys多態(tài)性與AMI之間可能存在相關(guān)性。hOGGlSer326Cys多態(tài)性與AMI之間是否真正存在相關(guān)性,是否通過(guò)影響其他臨床指標(biāo)的表達(dá)而影響AMI的發(fā)病等,文獻(xiàn)報(bào)道較少。為了進(jìn)一步探討hOGG1基因Ser326Cys多態(tài)性與AMI相關(guān)性,筆者還檢測(cè)了兩組的一般情況和相關(guān)臨床資料,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMI組的8-OHdG、FBG和LDL-C水平和吸煙及糖尿病例數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05),同時(shí)發(fā)現(xiàn)病例組hOGG1基因Cys/Cys基因型者8-OHdG、FBG和LDL-C水平進(jìn)一步增高。Botto等對(duì)DNA損傷進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,冠心病患者包括8-OHdG在內(nèi)的堿基損傷以及DNA鏈斷裂的水平明顯升高,8-OHdG升高的水平與冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)及冠狀動(dòng)脈狹窄程度成正相關(guān),并且DNA損傷與糖尿病及高血脂等冠心病的危險(xiǎn)因素也有關(guān)系。筆者的研究與上述結(jié)論部分一致。表明AMI與吸煙密切相關(guān),并與hOGG1基因型、8-OHdG、LDL、及FBG可能存在一定的關(guān)系。目前的研究表明,高血糖狀態(tài)加劇氧化應(yīng)激時(shí)DNA的損傷,脂質(zhì)代謝紊亂是造成動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素,血糖增高患者常伴發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂,從而誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生增多,導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂和心血管并發(fā)癥,而hOGG1基因多態(tài)性與修復(fù)DNA的活性相關(guān)。綜合上述觀點(diǎn),筆者推斷,hOGGl基因多態(tài)性可能影響hOGGl表達(dá),攜帶Cys/Cys基因型的個(gè)體hOGGl表達(dá)下降,使其識(shí)別和切除DNA雙鏈中的8-OHdG能力降低,即修復(fù)DNA氧化損傷的能力下降,體內(nèi)8-OHdG水平增加,使細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的突變率增高,喪失原有的細(xì)胞功能,誘