硫酸皮膚素衍生物對大鼠肥大細胞脫顆粒的影響

硫酸皮膚素衍生物對大鼠肥大細胞脫顆粒的影響

硫酸脫硅酶（sd）是一種結構復雜、硫酸化的糖胺聚糖（gogga），廣泛存在于動物組織中。它與硫酸乙酰肝素(HS)一樣,是血管壁外層蛋白聚糖的主要GAGs成分。分子結構主要是由IdoA-α(1→3)-GalNAc和GlcA-β(1→3)-GalNAc以及它們在C2、C4和C6位上硫酸化的衍生物組成。DS除具有抗血栓、抗凝血等作用外,還具有多種生物活性,如免疫調節(jié)、保護血管壁、抗病毒、抗平滑肌細胞增生、抗炎等。多硫酸化DS(poly-sulfatedDS,PSDS)具有較強抑制補體活性的作用,這表明DS參與了炎癥反應的調節(jié)。另外,DS是Versican(一種存在于細胞外間質的蛋白聚糖)的GAGs之一。Versican對黏附分子L-選擇素(L-selectin)和P-選擇素、趨化因子以及CD44的抑制作用依賴于其DS鏈與后者的結合,且DS鏈的硫酸化程度越高,其對L-選擇素、P-選擇素和趨化因子的抑制作用越強,而對CD44的抑制不依賴于DS的硫酸化。我們對不同分子量的LMWDS及PSDS通過大鼠被動肥大細胞(MC)脫顆粒實驗,進一步探討其結構與抗炎活性的關系。1實驗動物及試劑硫酸皮膚素寡糖BLMWDS-1、BLMWDS-2、BLMWDS-3,牛肺來源,自制,批號:021023;PLMWDS-1、PLMWDS-2、PLMWDS-3,豬腸來源,自制,批號:021113;PSDS,自制,批號:021202;色甘酸鈉,湖北潛江制藥股份有限公司;卵清蛋白,自制;氫氧化鋁凝膠,濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科;中性紅,上海試劑三廠;Hank液(不含酚紅,并用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液調pH值為6.9),自制。Wistar大鼠,山東大學實驗動物中心,動物合格證號:20021226。LEICA顯微鏡,德國IEICA公司;超級恒溫水浴,上海安亭科學儀器廠。2方法2.1不同劑量注射取卵清蛋白15mg,溶于4%氫氧化鋁凝膠50ml,混勻,給5只大鼠分別腹腔注射1ml/次,隔日1次,共7次。兩周后頸總動脈取血制備致敏血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2mc活性染料染色染色液:中性紅0.05%無水乙醇溶液?；铙w染色片:取上述染色液2～3滴,滴于清潔玻片上,然后將玻片在酒精燈火焰上來回微溫,待無水乙醇揮發(fā)后,染料即固定在玻片上,以供MC活體染色用。2.3沉淀物沉淀物制備將大鼠乙醚麻醉,由頸動脈放血致死。剪開腹部皮膚,將皮片向兩側翻開,然后向腹部內注入Hank液10ml,輕輕按摩腹部2～3min,打開腹部,以滴管將腹腔液收集于試管中,放入冰浴內冷卻,1000r/min離心10～15min,棄上清,將沉淀物輕輕混懸在Hank液1ml中,放冰浴內備用,不能過夜。2.4藥物用量的確定取試管9支分別加入正常大鼠MC懸液0.1ml,加入致敏大鼠血清0.05ml,搖勻,置37℃水浴中孵育2h,取出,加入Hank液0.2ml,搖勻,離心,棄上清,將細胞沉渣重新混懸在Hank液0.2ml中。9支試管中分別加入濃度為1mg/ml的表1中DS各衍生物水溶液、色甘酸鈉溶液和Hank液各40μl,接觸數分鐘,然后加入卵清蛋白至20μg/ml,在37℃水浴中孵育5min,冷卻,離心。用滴管分別吸取試管底部的MC,滴1滴于染色玻片上,輕輕晃動玻片,使液體與染料充分混合,放37℃溫箱3min后,顯微鏡400倍下觀察各試管中MC脫顆粒情況,計算脫顆粒率,并用數碼相機照相。取試管15支,分成3組,分別加藥物PSDS、BLMWDS-3、PLMWDS-3(藥物濃度均為1mg/ml)。方法同上。每組藥物用量為10、20、30、40、50μl。以上重復5次,分別計算MC脫顆粒率,并計算各組藥物對MC脫顆粒的抑制率。MC脫顆粒抑制率(%)=(1-用藥組MC脫顆粒率/Hank液組MC脫顆粒率)×100%3結果3.1物組和色甘酸鈉對mc脫顆粒作用的影響對卵清蛋白抗原引起的MC脫顆粒,與Hank液組比較,各DS衍生物組和色甘酸鈉組均能顯著減少脫顆粒的MC數(P<0.01),與色甘酸鈉組比較,PSDS組、BLMWDS-3組和PLMWDS-3組可顯著抑制MC脫顆粒作用(P<0.01),結果見表1和圖1。3.2抗癲癇藥物對mc脫軌的影響的劑量效應關系PSDS、BLMWDS、PLMWDS抑制MC脫顆粒作用與劑量呈正相關(見圖2)。4psds抑制mc脫顆粒作用機制MC脫顆粒是炎癥發(fā)生的重要機制之一。DS衍生物對大鼠MC的脫顆粒具有抑制作用,不同來源的DS其作用不同,并且隨著分子量的降低,其抑制作用加強。這是因為不同來源的DS具有不同的化學結構所致。PSDS抑制MC脫顆粒作用強,這與其結構上硫酸基的增加有關。有資料表明,肝素類藥物能特異性阻斷內