側(cè)腦室注射腎上腺髓質(zhì)素誘導(dǎo)大鼠fosh表達(dá)并調(diào)控兒茶酚胺神經(jīng)元的表達(dá)

側(cè)腦室注射腎上腺髓質(zhì)素誘導(dǎo)大鼠fosh表達(dá)并調(diào)控兒茶酚胺神經(jīng)元的表達(dá)

腎上腺髓質(zhì)素（am）是1993年日本科學(xué)家首次從嗜鉻細(xì)胞瘤組織中分離提取的新生物活性物質(zhì)。它由52個(gè)氨基酸組成。與鈣含量相關(guān)的基因（caclovac細(xì)胞（crp）具有多環(huán)芳烴的組成、結(jié)構(gòu)、受體結(jié)合的特點(diǎn)和生物活性，因此將am劃分為crp家族。AM及其受體不僅存在于外周組織也廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),目前認(rèn)為AM可以和兩種受體結(jié)合:CGRP受體和AM特異性受體。外周給予AM引起血管舒張、血壓下降,而腦室注射則引起血壓升高、心率加快及交感活動加強(qiáng)。AM在外周引起的血管舒張、血壓下降效應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)cAMP、NO-cGMP通路及K+通道的激活有關(guān)。而AM在中樞調(diào)節(jié)心血管作用的確切作用部位及作用機(jī)制未闡明。Smith和Ferguson最近的研究表明,室旁核內(nèi)微量注射AM引起血壓下降。而Allen等報(bào)道大鼠最后區(qū)內(nèi)微量注射AM引起血壓升高、心率加快,這與血管緊張素Ⅱ、血管升壓素及內(nèi)皮素的作用一致。我們以前的研究表明延髓腹外側(cè)頭端區(qū)內(nèi)微量注射腎上腺髓質(zhì)素引起大鼠血壓升高、心率加快及腎交感神經(jīng)放電增多。兒茶酚胺是重要的中樞遞質(zhì),參與調(diào)節(jié)心血管活動反射及下丘腦激素和外周兒茶酚胺的釋放,腦內(nèi)心血管相關(guān)核團(tuán)如孤束核、最后區(qū)、藍(lán)斑核和外側(cè)巨細(xì)胞旁核存在兒茶酚胺能神經(jīng)元。神經(jīng)元內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)可作為神經(jīng)元興奮的指標(biāo),酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase,TH)是兒茶酚胺合成的限速酶,可作為兒茶酚胺能神經(jīng)元活性的標(biāo)志。本研究利用Fos蛋白和TH雙重免疫組化技術(shù),觀察側(cè)腦室注射AM對大鼠心血管相關(guān)核團(tuán)Fos蛋白表達(dá)的影響,以論證AM在中樞的作用部位,并探討AM在中樞引起的升壓效應(yīng)是否通過激活兒茶酚胺能神經(jīng)元而實(shí)現(xiàn)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)選用雄性SD大鼠,體重250～300g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,于安靜、溫暖(23℃～25℃)、避強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)。1.2大鼠左腦室部位的確定實(shí)驗(yàn)大鼠以戊巴比妥鈉(40mg/kg體重)腹腔麻醉,借助立體定位儀將用9號注射針頭制成的帶心套管埋入大鼠左側(cè)腦室并用牙托粉固定,根據(jù)Paxinos和Watson圖譜確定左側(cè)腦室部位(前囟后0.8mm,旁開1.5mm,深度3.5～4.0mm)。動物術(shù)后7d,經(jīng)留置套管對其注射生理鹽水及藥物。1.3動物分組、注射藥物實(shí)驗(yàn)共分兩部分,第一部分:觀察AM的作用側(cè)腦室注射10μl無菌生理鹽水作為對照組,注射10μl無菌生理鹽水溶解的AM(3nmol/kg)為實(shí)驗(yàn)組。第二部分:觀察預(yù)先給予降鈣素基因相關(guān)肽受體拮抗劑CGRP8-37對AM作用的影響,以探討AM的作用是否由降鈣素基因相關(guān)肽受體介導(dǎo)。本部分分為以下四組:(1)溶劑對照+溶劑對照(vehicle+vehicle)側(cè)腦室注射5μl無菌生理鹽水,20min后再次注射5μl無菌生理鹽水。(2)溶劑對照+AM(vehicle+AM)側(cè)腦室注射5μl無菌生理鹽水,20min后注射5μl無菌生理鹽水溶解的AM(3nmol/kg)。(3)CGRP8-37+AM側(cè)腦室注射5μl無菌生理鹽水溶解的CGRP8-37(30nmol/kg,Sigma),20min后注射5μl無菌生理鹽水溶解的AM(3nmol/kg,Sigma)。(4)CGRP8-37+溶劑對照(CGRP8-37+vehicle)側(cè)腦室注射5μl無菌生理鹽水溶解的CGRP8-37(30nmol/kg),20min后注射5μl無菌生理鹽水。動物接受注射后2h,以戊巴比妥鈉(80mg/kg)深度麻醉,經(jīng)升主動脈的插管,先后灌入生理鹽水150ml、4℃4%多聚甲醛固定液500ml,1.5h后取出全腦,置入同樣固定液后固定4h,再入30%蔗糖溶液過夜(4℃)至下沉。冠狀冰凍切片厚30μm,每隔5張取1張,經(jīng)0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。1.4單克隆th免疫組織化學(xué)成分檢測切片用含0.3%TritonX-100處理后,按ABC法先進(jìn)行Fos免疫組織化學(xué)反應(yīng)。依次孵育于:(1)兔抗多克隆Fos抗體稀釋液(1∶500,SantaCruz)48h(4℃);(2)生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200,SantaCruz)(4℃過夜);(3)生物素-卵白素-辣根過氧化酶(HRP)復(fù)合物(ABC,1∶200,SantaCruz)4h(室溫)。以上每一步驟之后均用0.1mol/LPBS液充分漂洗3次,每次10min。最后以加有0.01%硫酸鎳胺的DAB呈色。切片經(jīng)0.1mol/LPBS液充分漂洗后進(jìn)行TH免疫組織化學(xué)反應(yīng)。依次孵育于:(1)小鼠單克隆TH抗體稀釋液(1∶500,Sigma)48h(4℃);(2)生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶200,SantaCruz)(4℃過夜);(3)生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(ABC,1∶200,SantaCruz)4h(室溫)。最后以0.04%的DAB呈色。常規(guī)裱片、脫水、透明和封片后,于光鏡下觀察、照相。雙標(biāo)記染色切片中,Fos呈硫酸鎳胺加強(qiáng)的棕黑色反應(yīng),位于細(xì)胞核內(nèi);TH抗體的染色為無硫酸鎳胺加強(qiáng)的棕黃色反應(yīng),存在于細(xì)胞質(zhì)中。1.5細(xì)胞均數(shù)的測定每只動物每個(gè)腦區(qū)選擇3～5張切片進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代表每張切片單側(cè)陽性細(xì)胞均數(shù),用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。對照組與實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞數(shù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;其他不同組別的細(xì)胞數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1fos-li神經(jīng)元/傳導(dǎo)束側(cè)腦室注射腎上腺髓質(zhì)素(3nmol/kg)誘發(fā)腦干、下丘腦及前腦等多個(gè)部位的心血管中樞出現(xiàn)大量Fos樣免疫反應(yīng)神經(jīng)元(Fos-LI)。在腦干,孤束核(NTS)、最后區(qū)(AP)、藍(lán)斑核(LC)、臂旁核(PB)和外側(cè)巨細(xì)胞旁核(PGL)內(nèi)Fos-LI神經(jīng)元顯著增加;在下丘腦,大量Fos-LI神經(jīng)元分布于室旁核(PVN)、視上核(SON)和下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH);在前腦,中央杏仁核(Ce)和外側(cè)韁核(LHb)內(nèi)Fos-LI神經(jīng)元顯著增加(表1)。2.2fos-th雙標(biāo)神經(jīng)元雙標(biāo)神經(jīng)元的形成在對照組動物,NTS、AP、PGL和LC中僅有少數(shù)Fos-TH雙標(biāo)神經(jīng)元。側(cè)腦室注射腎上腺髓質(zhì)素可引起這些核團(tuán)的雙標(biāo)神經(jīng)元數(shù)目顯著增加(表2,圖1和圖2,見彩圖頁Ⅰ)。2.3內(nèi)鏡fos蛋白表達(dá)和th免疫反應(yīng)神經(jīng)元的作用CGRP8-37(30nmol/kg)本身對腦內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)和TH免疫反應(yīng)神經(jīng)元無影響,但預(yù)先給予CGRP8-37可明顯減弱AM(3nmol/kg)的作用(圖3,圖4)。3討論3.1am在引導(dǎo)心血管需求領(lǐng)域的作用部位本研究表明,側(cè)腦室注射AM可引起腦內(nèi)廣泛區(qū)域的Fos蛋白大量表達(dá),腦干的孤束核、最后區(qū)、藍(lán)斑核、臂旁核和外側(cè)巨細(xì)胞旁核,下丘腦的室旁核、視上核和腹內(nèi)側(cè)核以及前腦的中央杏仁核和外側(cè)韁核等多個(gè)部位的心血管中樞出現(xiàn)大量Fos樣免疫反應(yīng)神經(jīng)元。側(cè)腦室注射AM引起血壓升高、心率加快及交感活動加強(qiáng)。盡管AM在中樞調(diào)節(jié)心血管作用的確切作用部位未明,本研究結(jié)果提示AM在中樞可直接或間接興奮腦干、下丘腦和前腦等多個(gè)部位的心血管中樞,誘發(fā)其心血管效應(yīng)。最后區(qū)或許是AM在中樞直接作用部位之一。最后區(qū)屬于室周器官,缺乏血腦屏障,血液循環(huán)中的一些活性物質(zhì)可通過直接作用于最后區(qū)而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Allen等報(bào)道大鼠最后區(qū)內(nèi)微量注射AM引起血壓升高、心率加快;我們以前的研究表明頸動脈注射腎上腺髓質(zhì)素引起大鼠最后區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電增加。3.2新生兒神經(jīng)元的變化在本實(shí)驗(yàn)中觀察到,側(cè)腦室注射AM引起NTS、AP、PGL和LC中Fos-TH雙標(biāo)神經(jīng)元顯著增加,提示AM可興奮這些核團(tuán)的兒茶酚胺神經(jīng)元。兒茶酚胺是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì),包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺,腦內(nèi)兒茶酚胺神經(jīng)元主要包括去甲腎上腺素能的A1～A7細(xì)胞群、腎上腺素能的C1～C3細(xì)胞群和多巴胺細(xì)胞群。PGL是延髓腹外側(cè)頭端區(qū)調(diào)節(jié)血管張力和維持動脈血壓的關(guān)鍵部位,該核團(tuán)內(nèi)C1區(qū)的神經(jīng)元投射至脊髓中間外側(cè)柱興奮其交感節(jié)前神經(jīng)元;AP內(nèi)C2區(qū)神經(jīng)元、NTS內(nèi)A2區(qū)神經(jīng)元及LC內(nèi)A6區(qū)神經(jīng)元均有纖維直接投射至PGL,參與血壓調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AM在中樞引起的升壓效應(yīng)是由激活NTS、AP、PGL和LC中兒茶酚胺神經(jīng)元實(shí)現(xiàn)的。3.3am作用受體抗劑目前認(rèn)為AM可以和兩種受體結(jié)合:CGRP受體和AM特異性受體。但AM在中樞通過哪種受體起作用尚有爭議。Takahashi和Saita的研究表明CGRP受體拮抗劑CGRP8-37可減弱AM的中樞作用;而Samon和Smith的研究結(jié)果表明CGRP受體拮抗劑CGRP8-37不影響AM的中樞作用,AM的中樞作用是通過AM特異性受體。本研究的結(jié)果顯示,CGRP8-37可明顯減弱AM的中樞作用,提示AM的中樞