乳酸脫氫酶試劑盒說明書

第第頁乳酸脫氫酶試劑盒說明書乳酸脫氫酶（LactateDehydrogenase，LDH）試劑盒說明書微量法100管/48樣注意：正式測定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：LDH（EC1.1.1.27）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD+/NADH之間互變。測定原理：LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2,4二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。需自備的儀器和用品：可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制：提取液：60mL×1瓶，4℃保存；試劑一：液體5mL×1瓶，4℃保存；試劑二：粉劑×1支，20℃保存，用時(shí)加入10μL試劑五和1.3mL蒸餾水充分溶解備用，用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融；試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存；試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；試劑五：液體100μL×1支，4℃保存；樣品測定的準(zhǔn)備：1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。測定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。2、樣本測定（在EP管中加入下列試劑）試劑名稱(μL)測定管對(duì)照管樣本1010試劑一5050試劑二10蒸餾水10充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴15min試劑三5050充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴15min試劑四150150充分混勻，室溫靜置15min，450nm下測定吸光度，計(jì)算ΔA=A測定管A對(duì)照管。每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。LDH活力單位的計(jì)算：a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線，y=0.9108x+0.0037(x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y為ΔA)。2、血清（漿）LDH活力的計(jì)算單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/mL）=（ΔA0.0037）÷0.9108÷T×103=73.2×ΔA3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/mgprot）=[（ΔA0.0037）÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103=73.2×ΔA÷Cpr需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。（2）按樣本鮮重計(jì)算：單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA0.0037）÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103=73.2×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/104cell）=[（ΔA0.0037）÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103=0.037×ΔAV1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬；103：1umol/mL=103nmol/mL。b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下：1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線，y=0.4554x+0.0037(x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y為ΔA)。2、血清（漿）LDH活力的計(jì)算單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/mL）=（ΔA0.0037）÷0.4554÷T×103=146.4×（ΔA0.0037）3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/mgprot）=[（ΔA0.0037）÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103=146.4×（ΔA0.0037）÷Cpr需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。（2）按樣本鮮重計(jì)算：單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA0.0037）÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103=146.4×（ΔA0.0037）÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。LDH（nmol/min/104cell）=[（ΔA0.0037）÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103=0.073×（ΔA0.0037）V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15