多拉菌素注射液含量測(cè)定中適用的固相萃取柱考察研究

多拉菌素注射液含量測(cè)定中適用的固相萃取柱考察研究劉少寧，李有志，王艷芬，李淑花，王燕，徐恩民基金項(xiàng)目：2015年國家科技支撐計(jì)劃基金項(xiàng)目：2015年國家科技支撐計(jì)劃“獸藥安全與質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)研究與應(yīng)用”編號(hào)“BAD11B03-01”作者簡(jiǎn)介：劉少寧，高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸藥及畜產(chǎn)品質(zhì)量安全方面的檢測(cè)和科研工作。E-mail：liushaoning-6@163.com通訊作者：徐恩民。E-mail：xuenm@126.com(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250022)[摘要]過于單薄。為完善多拉菌素注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)多拉菌素注射液含量測(cè)定中適用的固相萃取柱進(jìn)行了考察研究。采用C18色譜柱（5μm數(shù)字與英文單位之間空一格，全文核查修改。，150mm×4.6mm），以甲醇-乙腈-水（67：15：18）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫（流速為1.0mL/min），以檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，流速為1.0mL/min進(jìn)樣量20μL。經(jīng)線性、準(zhǔn)確度、精密度、耐用性和穩(wěn)定性試驗(yàn)考察后，結(jié)果表明表明：，該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，考察的固相萃取柱能用于多拉菌素注射液含量的測(cè)定。過于單薄。數(shù)字與英文單位之間空一格，全文核查修改。[關(guān)鍵詞]多拉菌素；含量測(cè)定；固相萃取柱StudyontheApplicationofSolidPhaseExtractionColumnintheContentDeterminationofDoramectinInjectionLIUShao-ning，LIYou-zhi，WANGYan-fen，LIShu-hua，Wang-yan，XUEn-min＊(ShandongInstituteofVeterinaryDrugQualityInspection，ShandongKeyLaboratoryforQualitySafetyMonitoringandRiskAssessmentofAminalProducts，ShandongJinan250022，China)Abstract：存有較多的語法錯(cuò)誤與不規(guī)范表達(dá)。Inordertoimprovethequalitystandardofdoramectininjection,thesolidphaseextractioncolumnsuitableforthedeterminationofdoramectininjectionwasinvestigated.AC18column(5μm,150mm×4.6mm)wasused,andamethanol-acetonitrile-water(67:15:18)mobilephasewasused,withadetectionwavelengthof245nm,andaflowrateof1.0mL/min.Theresultsshowthatthemethodisaccurate,simpleandrapid,andthesolidphaseextractioncolumncanbeusedtodeterminethecontentofdoramectininjection.ChromatographywasperformedonC18column(5μm,150mm×4.6mm),isocraticelutionwithmethanol-acetonitrile-water(67:15:18)asmobilephase(flowrate1.0mL/min).Thedetectionwavelengthwas245nm,Theinjectedvolumewas20μL.Afterlinearity,accuracy,precision,durabilityandstabilitytest,theresultsshowedthatthemethodisaccurate,simpleandrapid.Thesolidphaseextractioncolumncanbeusedtodeterminethecontentofdoramectininjection.存有較多的語法錯(cuò)誤與不規(guī)范表達(dá)。Keywords：Doramectin；contentdetermination；solidphaseextractioncolumn多拉菌素（Doramectin）是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，屬伊維菌素的衍生物。主要用于治療胃腸道蛔蟲，肺蠕蟲，眼絲蟲，虱和疥螨等引起的寄生蟲病[1,23]按順序依次標(biāo)注。。固相萃取技術(shù)（solidphaseextraction，SPE）是近年發(fā)展起來的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，其原理是利用組分與吸附劑（固定相）間選擇性吸附與選擇性洗脫的過程，達(dá)到提取分離、凈化和富集的目的。當(dāng)應(yīng)用于性狀為油狀的獸藥產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，其分離效果較好。多拉菌素注射液性狀為無色或微黃色的油狀液體，收載在2017版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)品卷，標(biāo)準(zhǔn)【含量測(cè)定】中標(biāo)注的LC-Si固相萃取柱（4.6×150mm，5μm）難以購買，且不適合常用固相萃取裝置，給檢測(cè)單位和企業(yè)帶來麻煩。本研究依據(jù)現(xiàn)行的多拉菌素注射液標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)含量測(cè)定中適用的固相萃取柱進(jìn)行考察試驗(yàn)，完善了多拉菌素注射液含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)[32]。按順序依次標(biāo)注。1儀器與材料1.1儀器Agilent1260型高效液相色譜儀；WatersAllianceE2695型高效液相色譜儀；色譜柱AgilentZORBAXSB-C18（5μm，150mm×4.6mm）；電子天平（型號(hào)BT125D）購自德國賽托里斯公司。1.2試藥與試劑多拉菌素對(duì)照品（批號(hào)為K0461411，標(biāo)識(shí)含量為95.6%）來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；多拉菌素注射液（批號(hào)：1812002規(guī)格：50mL：0.5g）來源于山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司；多拉菌素注射液（批號(hào)：1812001規(guī)格：100mL：1g）來源于齊魯動(dòng)物保健品有限公司；多拉菌素注射液（批號(hào)：PS185-1902001規(guī)格：50mL：0.5g）來源于艾美科?。ㄖ袊┥镝t(yī)藥有限公司；多拉菌素注射液（批號(hào)：D801SICN規(guī)格：50mL：0.5g）來源于施維雅（青島）生物制藥有限公司。固相萃取小柱SupelcleanTMLC-Si6mLl（500mg）SPETubes購自美國Supelco公司；固相萃取小柱Sep-PakVac6cc（500mg）SilicaCartridges購自美國Waters公司；甲醇為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；水為純化水，其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1色譜條件流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（67：15：18）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)245nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照品溶液的制備取多拉菌素對(duì)照品10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇70mL溶解，加水5mL，混勻，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻。2.2.2供試品溶液的制備精密量取1812002批樣品（50mL:0.5g）1mL至10mL容量瓶中，加二氯甲烷9mL稀釋制成每1mL中約含1mg的溶液，精密量取2.5mL，過LC-Si固相萃取柱（500mg/6mL），依次用正己烷6.25mL，二氯甲烷12.5mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5mL洗脫，洗脫液收集于25mL量瓶中，加水1.25mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。2.2.3空白溶液的制備精密量取輔料溶液1mL至10mL容量瓶中，加二氯甲烷9mL定容。精密量取2.5mL，過LC-Si固相萃取柱（500mg/6mL），依次用正己烷6.25mL，二氯甲烷12.5mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5mL洗脫，洗脫液收集于25mL量瓶中，加水1.25mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。2.3系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)精密量取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各20μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果理論塔板數(shù)為6454，供試品溶液色譜圖中多拉菌素峰與對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間一致（圖1）。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測(cè)要求，供試品中其它成分對(duì)多拉菌素定量檢測(cè)無干擾，專屬性能滿足檢測(cè)要求。圖1專屬性試驗(yàn)色譜圖（A、B、C分別為多拉菌素對(duì)照品、魯抗舍里樂藥業(yè)多拉菌素注射液供試品、魯抗舍里樂藥業(yè)多拉菌素注射液輔料）Fig1HPLCchromatogramsofspecifictest2.4線性關(guān)系考察取多拉菌素對(duì)照品貯備液（濃度約1mg/mL），分別精密吸取適量，配制濃度約0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的系列溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=4E+07x+56549（R2＝1），結(jié)果表明進(jìn)樣濃度在0.01～0.8mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.5準(zhǔn)確度采用加標(biāo)回收的方法，在空白輔料溶液中，按工藝加入一定質(zhì)量的多拉菌素對(duì)照品，分別配制80%、100%、120%濃度的多拉菌素注射液，分別制備3份。按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD（結(jié)果見表1）。結(jié)果表明：在三個(gè)濃度水平下，多拉菌素注射液回收率為100.2%，符合注射液回收率98%~101%的范圍要求，證實(shí)了該方法具有良好的準(zhǔn)確度。表1回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab1Resultofrecoverytest樣品濃度實(shí)際添加(mg)理論測(cè)得(mg)回收率（%）平均值（%）RSD（%）80%-1200.18199.7799.79100.20.680%-2200.86202.62100.8780%-3200.61201.49100.44100%-1250.33248.6399.32100%-2251.67253.67100.80100%-3251.16250.2399.63120%-1300.23301.41100.39120%-2301.37303.19100.61120%-3301.21301.55100.112.6精密度2.6.1儀器精密度補(bǔ)充平均值。取2.2.1對(duì)照品溶液，精密量取20μL，按2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得多拉菌素峰面積RSD為0.2%，表明儀器有良好的精密度。結(jié)果見表2。補(bǔ)充平均值。表2儀器精密度試驗(yàn)序號(hào)123456平均值峰面積4295277430397143109984306262431282543073544306114RSD（%）0.2/Tab2Resultofinstrumentprecisiontest2.6.2重復(fù)性取供試品（批號(hào)為1812002）注射液，按2.2.2方法配制6份樣品溶液，按2.1色譜條件，每份樣品進(jìn)樣2次，結(jié)果含量平均值為104.6%，RSD為0.9%。結(jié)果見表3。表3重復(fù)性試驗(yàn)Tab3Resultofrepeatabilitytest試驗(yàn)號(hào)123456平均值含量（%）104.7103.8104.1104.2104.7106.4104.6RSD（%）0.9/2.6.3中間精密度取供試品（批號(hào)為1812002）注射液，換由另一位操作者按2.2.2方法配制6份樣品溶液，選用WatersAllianceE2695液相色譜儀，WatersX-bridgeC18色譜柱按2.1色譜條件，每份樣品進(jìn)樣2次，結(jié)果含量平均值為103.8%，RSD為0.6%。結(jié)果見表4。表4中間精密度試驗(yàn)Tab4Resultofintermediateprecisiontest序號(hào)123456平均值含量（%）104.5104.3103.1103.3103.8103.6103.8RSD（%）0.6/2.7耐用性2.7.1不同品牌固相萃取小柱耐用性試驗(yàn)：取供試品溶液按照2.2.2方法考察市面上在售的兩款固相萃取小柱：①SupelcleanTMLC-Si6mL（500mg）SPETubes；②WatersSep-PakVac6cc（500mg）SilicaCartridges。測(cè)定結(jié)果詳見表5。由表5可見，兩個(gè)廠家的固相萃取柱對(duì)含量測(cè)定的結(jié)果差異不顯著。市售的這兩款固相萃取柱均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。表5不同固相萃取柱測(cè)定多拉菌素含量Tab5DeterminationofDoramectincontentbydifferentSPEcolumns固相萃取柱品牌編號(hào)樣品峰面積樣品峰面積平均值對(duì)照品峰面積對(duì)照品峰面積平均值含量（%）①439802743995644398795.5412862340580534093338104.2②439891743989064398911.5缺小標(biāo)題。方法耐用性試驗(yàn)：取1812002批樣品（50mL:0.5g），按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，將色譜條件微小變動(dòng)進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性。結(jié)果表明該方法能夠耐受不同色譜柱、柱溫、流速等因素的小范圍變化，測(cè)得多拉菌素注射液中多拉菌素的含量無明顯差異，說明耐用性良好，結(jié)果見表6。缺小標(biāo)題。表6色譜條件微小變動(dòng)后的結(jié)果Tab6Resultsofminorchangesinchromatographicconditions條件結(jié)果(%)平均(%)RSD(%)AgilentZORBAXSB-C18104.7104.80.3WatersX-bridgeC18104.5InertsilODS-3105.1流速0.8mL/min105.0105.00.3流速1.0mL/min104.7流速1.2mL/min105.2柱溫33℃104.7105.20.3柱溫35℃105.0柱溫37℃105.82.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品（批號(hào)為1812002）的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，立即測(cè)定，再在2、4、8、12、16、20、24h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)峰面積均與0小時(shí)比較，12小時(shí)內(nèi)相對(duì)偏差小于1%，結(jié)果提示樣品應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。展開說明原因。結(jié)果詳見表7。展開說明原因。表7穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab7Stabilitytest時(shí)間（h）峰面積與0小時(shí)比較相對(duì)偏差(%)04995717/249982030.04450114050.23850008690.081250559230.851651026611.502051566252.252451413872.042.9樣品含量測(cè)定取不同廠家的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，上機(jī)測(cè)定峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算多拉菌素的含量，含多拉菌素均在標(biāo)示量的90.0%～110%。結(jié)果見表8。表8不同廠家樣品測(cè)定結(jié)果Tab8Resultsofsamplesfromdifferentmanufacturers生產(chǎn)廠家批號(hào)規(guī)格含量（%）齊魯動(dòng)保1812001100mL：1g102.0魯抗舍里樂181200250mL：0.5g104.1艾美科健PS185-1902001100mL：1g100.8施維雅D801SICN50mL：0.5g100.63討論缺少與其它學(xué)者相關(guān)研究的具體對(duì)比與深入分析，深度欠佳。與結(jié)論缺少與其它學(xué)者相關(guān)研究的具體對(duì)比與深入分析，深度欠佳。3.1色譜條件的選擇與確定研究過程中對(duì)樣品的溶劑及色譜條件中流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速進(jìn)行了嚴(yán)格的選擇性考察。研究表明，甲醇-乙腈-水（67：15：18）作為流動(dòng)相，1.0mL/min的流速在245nm波長(zhǎng)下色譜峰分離效果好，峰形較好[4-6]。3.2樣品前處理方法的選擇多拉菌素注射液性狀為無色或微黃色澄明油狀液體，是一類抗寄生蟲藥[7-9]。參考2017版《中華人民共和國獸藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2015年版化學(xué)品卷一部多拉菌素注射液含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，本研究采用固相萃取小柱進(jìn)行樣品的前處理，降低了樣品的基質(zhì)背景，凈化和富集了目標(biāo)化合物，提高了樣品分析結(jié)果的可靠性和靈敏度[10,11]。結(jié)果證明該方法能夠較為完全地提取出多拉菌素注射液中的多拉菌素，并且方法的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性均能達(dá)到檢測(cè)的要求[12，13-14]。3.3固相萃取小柱的選擇與啟示固相萃取技術(shù)與傳統(tǒng)的液液萃取法相比，可具有提高藥物回收率，能更加有效的將藥物與干擾組分分離等作用。商品化的固相萃取小柱（SPE柱）使得整個(gè)過程具有較高的重現(xiàn)性，能夠?qū)崿F(xiàn)多樣品的平行處理，大大提高檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)液體樣品溶液通過固相吸附層時(shí)，被測(cè)物被富集，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量溶劑迅速洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的。需要注意的是：在選擇固相萃取柱時(shí)，要考慮固相吸附層的吸附能力，避免實(shí)際操作時(shí)出現(xiàn)應(yīng)避免過載現(xiàn)象。SPE柱應(yīng)用于多拉菌素注射液等油性的含量測(cè)定取得了對(duì)于分離效果不好的獸藥產(chǎn)品時(shí)，能夠有效的將有效成分與雜質(zhì)進(jìn)行分離，并且重現(xiàn)性較高[14]。以往的研究中SPE柱多用于獸藥殘留的檢測(cè)，本試驗(yàn)對(duì)于其它分離效果不理想的獸藥產(chǎn)品的檢測(cè)提供了新的思路。3.34結(jié)論用高效液相色譜法測(cè)定多拉菌素注射液中多拉菌素的含量時(shí)，采用固相萃取小柱進(jìn)行前處理，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，回收率高，可有效控制該制劑中多拉菌素的含量。參考文獻(xiàn)：中國獸藥典委員會(huì).《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部[S].ChinaVeterinaryPharmacopoeiaCommittee.People'sRepublicofChinaVeterinaryPharmacopoeiavolumeⅡ2015edition[S].中國獸藥典委員會(huì).獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).化學(xué)藥品卷2017年版[S].ChinaVeterinaryPharmacopoeiaCommittee.Veterinarydrugqualitystandard.ChemicalVolume.2017Edition[S].高玉紅，龐淑華，高玉閣，等.多拉菌素的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017，23：93-96.GaoYH，PangSH，GaoYG，etal.Researchprogressofdoramectin[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine，2017，23：93-96.[3]中國獸藥典委員會(huì).獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).化學(xué)藥品卷2017年版[S].ChinaVeterinaryPharmacopoeiaCommittee.Veterinarydrugqualitystandard.ChemicalVolume.2017Edition[S].[4]潘劍，陶云國.陶瓷膜法提取多拉菌素的研究[J].中國抗生素雜志，2017，9：775-779.PanJ，TaoYG.Studyonextractionofdoramectinbyceramicmembrane[J].ChineseJournalofAntibiotics，2017，9：775-779.[5]GOKBULUTC,NOLANAM,MCKELLARQA.

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