大鼠前庭5-羥色胺1a受體亞型免疫結構的觀察

大鼠前庭5-羥色胺1a受體亞型免疫結構的觀察

大鼠前庭神經核綜合體（vlc）是由多個神經核組成的腦區(qū)域。位于第四腦室底部。它的尾部很長，從三叉神經運動的頭部兩側到舌下神經核的吻部。VNC除接受來自前庭器官的初級傳入以外,與腦內許多結構,如小腦、脊髓、運動眼球的多個核團等都有纖維聯(lián)系;其功能復雜、多樣,與軀體定向、身體平衡、眼球運動和前庭-自主神經反射等有關。根據(jù)VNC在腦內的傳入、傳出纖維聯(lián)系和化學神經解剖學等特點,將VNC主要分為前庭上核(superiorvestibularnucleus,SuVe)、前庭外側核(lateralvestibularnucleus,LVe)、前庭內側核(medialvestibularnucleus,MVe)、前庭下核(inferiorvestibularnucleus,SpVe)以及X和Y兩個細胞群。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是腦內重要的感覺、運動信息調節(jié)物質,具有復雜的生理作用。束路追蹤研究證明,來自腦內中縫核簇的5-HT能神經元向VNC的許多核團,如MVe、SpVe、LVe和SuVe等都有纖維投射,表明5-HT可通過上述VNC內神經元上的5-HT受體發(fā)揮其對神經元活動的調節(jié)作用。5-HT對VNC神經元的作用,也得到電生理學的證明,并提示在VNC內存在不同的5-HT受體;同時免疫組織化學和原位分子雜交研究也證明VNC內含5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2C等不同5-HT受體亞型。然而,采用離子電滲和微量注射5-HT后,在體對大鼠VNC神經元活動所進行的記錄表明,5-HT對MVe、LVe和SuVe等核團神經元發(fā)揮不同作用,既有抑制又有興奮效應,5-HT引起興奮和抑制的神經元在VNC不同核團內的比例有所不同。以上結果提示,表達不同5-HT受體亞型的神經元比例在VNC各核團有差異。迄今為止,有關VNC內5-HT受體亞型在不同亞核內的分布尚缺乏系統(tǒng)的研究資料。5-HT1A受體(5-HT1AR)屬于G蛋白耦聯(lián)受體,可以介導5-HT對前庭核神經元活動的調節(jié)作用,從而在前庭反射的調節(jié)中發(fā)揮重要作用。但是,有關5-HT1AR在VNC內的研究卻很局限。例如,原位分子雜交的結果證明LVe、MVe、SuVe和SpVe內的神經元在mRNA水平有表達,但在蛋白質水平只報道了VNC內5-HT1AR在MVe內有分布。目前,有關VNC各核團內5-HT1AR在蛋白質水平表達與分布的研究仍缺乏詳細資料。為進一步深入理解5-HT對VNC不同核團神經元的作用,本研究應用免疫組織化學技術對5-HT1AR亞型在VNC內的分布進行了系統(tǒng)的研究。材料和方法1.灌流固定、切片實驗采用正常成年雄性SD大鼠6只,體重200～250g(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)。以戊巴比妥鈉(40mg/kg體重)注入腹膜腔麻醉,經左心室插管至升主動脈進行灌流固定。先用100ml0.05mol/L磷酸緩沖液配制的生理鹽水(PBS,pH7.3)沖洗血液,然后用500ml含4%多聚甲醛和75%(v/v)飽和苦味酸的0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH7.3)灌注固定。灌畢立即取腦干并置于上述新鮮固定液中后固定2～4h,再將腦干移入含30%蔗糖的0.05mol/L的PB中,4℃過夜。最后在冰凍切片機上進行連續(xù)冠狀切片,片厚25μm。切片隔2取1,分3套收集于0.05mol/L的PBS(pH7.3)中。2.免疫組化染色用常規(guī)免疫組織化學方法(ABC法)于室溫下對第1套切片進行免疫細胞化學染色?；静襟E如下:(1)豚鼠抗5-HT1ARIgG(1∶1000,Chemicon)孵育24h;(2)Biotin結合的羊抗豚鼠IgG(1∶200,Vector)孵育4h;(3)ABC復合物(1∶100,Vector),孵育2h;(4)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和H2O2呈色。上述各步驟之間均用0.05mol/L的PBS(pH7.3)洗片3次,每次10min。其中一抗和二抗用含5%驢血清、0.5%TritonX-100、0.25%角叉菜膠和0.05%疊氮鈉的0.05mol/L的PBS稀釋(pH7.3),ABC用含0.5%TritonX-100的0.05mol/L的PBS稀釋。裱片、室溫干燥、脫水、透明、封片,顯微鏡觀察。第2套切片用于Nissl染色,以便定位免疫組化染色的陽性結構并劃分有關核團的界限。用正常豚鼠血清代替一抗孵育第3套切片,隨后的步驟與上述染色程序相同,進行對照實驗,結果為陰性。3.核酸陽性神經元/細胞陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/陽性神經元/細胞內聯(lián)系5-HT1AR陽性神經元計數(shù)來自6只大鼠,每只大鼠每個核團分別記錄吻、中和尾部各3張腦切片上5-HT1AR陽性神經元的數(shù)目,在每張切片所計數(shù)的核團內隨機取4個(3×104)μm2的樣本進行計數(shù),只計數(shù)含細胞核的陽性神經元。數(shù)據(jù)分析時,按照(3×104)μm2范圍內5-HT1AR陽性神經元的平均數(shù)量,然后描述每個核團吻、中和尾平面神經元密度,即以(3×104)μm2內陽性神經元數(shù)目表示,區(qū)分為:密集(++++,≥10個)、中等密度(+++,7～9個)、低密度(++,4～6個)和稀疏(+,1～3個)四個級別(表1)。核團中5-ht1a免疫陽性神經元表達分布免疫組織化學結果顯示,整個VNC從吻側到尾側各核團內都有5-HT1AR陽性神經元分布(Fig.1)。顯微鏡觀察顯示,5-HT1AR免疫陽性反應產物彌散分布于胞漿中,也見于部分神經元近側端樹突(Fig.1B～D);陽性神經元胞體在不同部位其染色強度有差異,在胞漿中的分布亦不均勻,部分陽性神經元輪廓較模糊。此外,在神經元胞體和突起中也觀察到點狀的陽性反應產物,這些陽性產物的染色強,其分布密度在胞漿中較為均勻;在神經元中也觀察到稀疏點狀淡染的陽性結構,其在MVe和LVe內的密度更大些(Fig.1B,C)。在VNC每個核團,不同的5-HT1AR免疫反應陽性神經元染色強度有區(qū)別,呈強、中等和弱之分。神經元計數(shù)結果顯示,VNC各核團之間5-HT1AR陽性神經元分布密度不同,MVe內陽性神經元密度最高,而在其它核團內陽性神經元密度較為接近;進一步觀察到每一核團的吻端、中間部和尾端,免疫陽性神經元分布密度基本一致(表1)。SuVe內含較多淡染的中、小型多極神經元,呈圓形、卵圓形或梭形,散在分布。此核團5-HT1AR陽性神經元分布較均勻,但比較而言,其中部密度略高于吻、尾部。MVe的大、小細胞部均有較高密度的5-HT1AR免疫陽性神經元分布,其中小型神經元多呈卵圓形、梭形或三角形;MVe小細胞部多數(shù)神經元免疫反應產物局限于神經元的胞體,個別神經元可見較長的陽性突起;大型神經元多呈三角形。LVe內5-HT1AR免疫陽性神經元多呈大多角型,也有較小的陽性神經元散在分布;較之其它核團而言,該核團內陽性神經元突起長而明顯。此核的神經元在其全長均呈較低密度分布,但染色較深。SpVe內含有深染的大型多極神經元,部分神經元突起染色明顯;陽性神經元在吻、中平面呈低密度分布,尾部呈中等密度分布。X和Y核團內均為淡染的中等大小的細胞組成,呈低密度分布。-ht1a神經元概述既往關于5-HT1AR在中樞神經系統(tǒng)分布的研究已有較多報道,應用放射自顯影和原位雜交技術進行的研究表明,5-HT1AR在腦內有較廣泛的分布,而針對5-HT1AR在蛋白質水平表達的資料較少,Kia等采用免疫組織化學和放射自顯影技術對全腦的普查結果表明該受體在MVe有分布,但未說明其在VNC其它核團內的分布情況。本研究觀察到5-HT1AR在大鼠VNC各個核團內都有分布,這與以往原位雜交的結果基本一致,提示該受體在VNC的各個核團內都介導著5-HT對部分神經元活動的調節(jié)作用。本實驗所觀察到的LVe、MVe和SuVe中有些神經元表達5-HT1AR的結果與電生理學實驗結果相一致,即應用離子電滲技術將5-HT1AR激動劑坦度螺酮(tandospirone)或8-OH-DPAT注入上述核團內后,相關神經元對谷氨酸的反應會被增強或抑制。Wright等應用原位分子雜交技術表明,LVe、MVe、SuVe和SpVe中都有5-HT1ARmRNA表達,其中MVe內mRNA表達較弱。這一結果與本研究觀察到的MVe內5-HT1AR蛋白表達最強不一致。究其原因,可能有兩個方面:(1)前者在研究中采用的計量指標包含了標記強度和陽性細胞數(shù)量兩個部分,我們只計數(shù)了5-HT1AR免疫反應陽性神經元的數(shù)量;(2)已有研究證明,在腦干的某些核團內mRNA表達的強弱與蛋白質表達之間并不完全呈正相關性。本研究觀察到5-HT1AR定位于胞體和樹突,以往研究證明,在其它腦區(qū),如前腦的隔區(qū)、大腦皮層、丘腦以及延髓等結構中,5-HT1AR也定位于神經元胞體和樹突,兩者結果一致。由此可見,5-HT可通過胞體和樹突上的5-HT1AR發(fā)揮其對神經元活動的調節(jié)作用。有諸多研究報道,作用于VNC的5-HT來自中縫核簇,其作用可通過VNC神經元上表達的5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2C等受體所介導,其中5-HT可激活MVe、LVe與SuVe等核團內神經元上的5-HT1AR,增強或抑制興奮性突觸傳入引起的興奮性效應。LVe和SuVe神經元分別與身體姿勢控制和眼球運動有關,細胞外記錄研究證明,5-HT1AR激活可增強LVe和SuVe神經元對谷氨酸的反應;而MVe神經元放電頻率則可被5-HT1AR的激動劑所降低。因此,5-HT1AR介導的效應并非一致,這可能與表達5-HT1AR的神經元類型有關。VNC神經元接受來自半規(guī)管和前庭內壺腹嵴、橢圓囊斑(球囊斑)等感受器傳來的刺激,感受頭部旋轉、直線加速運動。然后,通過將信息傳遞至上位腦中樞不同區(qū)域,如動眼/滑車神經核、脊髓、小腦以及腦干等,完成不同生理與行為反射活動。因此,我們推測5-HT1AR介導的不同效應很可能與VNC內神經元的類型關系密切。識別神經元的類型并結合相關功能后,再對特定類型的神經元上5-HT1AR進行研究,將對闡明5-HT1AR的功能有重要意義。關于VNC神經元的5-HT1AR介導5-HT作用的胞內信號轉導機制,目前尚不清楚。據(jù)文獻報道,5-HT1AR介導的神經元效應存在多種信號轉導途徑