5-h2和5-h3受體亞型在5-h誘導(dǎo)外周痛反應(yīng)和痛調(diào)制中的相互作用

5-h2和5-h3受體亞型在5-h誘導(dǎo)外周痛反應(yīng)和痛調(diào)制中的相互作用

各種炎癥介質(zhì)包括h-和p物質(zhì)（sp）、5-羥色胺（5-ht）、緩沖液（bk）、前列腺素（pg）和三丙烯酸（parkam）。當(dāng)被組織損傷或炎癥釋放時，5-ht是一種非常重要的外圍疼痛物質(zhì)。相應(yīng)的受體可分為7種類型和至少14種類型。5-ht3受體為配體門控離子通道，其他受害者為g蛋白偶聯(lián)體受體。目前有的報道表明了在初級感覺神經(jīng)元上5-HT受體亞型的分布:背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上的分布為,5-HT1B,D,F,5-HT2A,C,5-HT3,5-HT4,5-HT5A,B,而5-HT1A,E,5-HT2B,5-HT5,5-HT6則缺乏;三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上的分布為,5-HT1A,B,D,5-HT2A,5-HT3,5-HT4,5-HT6。這些受體亞型在5-HT引發(fā)的傷害性信息形成和調(diào)制中的作用及其相互關(guān)系尚不很清楚。本文采用全細胞膜片鉗技術(shù)在分離的大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminalganglion,TG)神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn),5-HT2受體激動劑α-methyl-5-HT能增強5-HT3受體介導(dǎo)的電流,而5-HT1受體激動劑UH-301則無此作用。我們在電生理資料結(jié)果的基礎(chǔ)上應(yīng)用行為學(xué)方法在整體動物水平上同時觀察和探討5-HT2和5-HT3受體在外周初級感覺神經(jīng)末梢傷害性信息的產(chǎn)生和調(diào)制中的相互作用及其可能機制。1材料和方法1.1電生理實驗1.1.1神經(jīng)節(jié)的剪碎TG細胞急性分離方法概述如下:雄性SD大鼠100～150g(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供),擊昏斷頭后,迅速切開顱頂部皮膚暴露出顱骨,沿矢狀縫打開顱骨,切除大腦后即可見到位于顱底硬腦膜下的三叉神經(jīng)節(jié)及其分支。小心剝離硬腦膜后迅速取出雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)置于氧飽和的DMEM(Dubecco’sModifiedEagle’sMedium)內(nèi),pH7.4,滲透壓為340mOsm/kg。在體視顯微鏡下用精細彈簧剪及游絲鑷仔細去除周圍的結(jié)締組織被膜,將清除干凈的三叉神經(jīng)節(jié)盡可能地剪碎。置培養(yǎng)瓶內(nèi),然后加trypsin(typeⅡ-S,Sigma)0.5g/L,collagenase(typeⅠA,Sigma)1.0g/L,DNase(typeⅢ,Sigma)0.1g/L,在恒溫震蕩水浴器(35°C,80counts/min)中孵育30～40min。孵育畢,加入1.25mg/mlSoybeantrypsininhibitor(typeⅡ-S,Sigma)以中止酶的消化作用。將上述機械分離的三叉神經(jīng)節(jié)細胞轉(zhuǎn)移至一35mm培養(yǎng)皿內(nèi),放在倒置顯微鏡的載物臺上靜置至少30min。1.1.2.灌流用外液全細胞膜片鉗記錄所用儀器為CEZ-2400型膜片鉗放大器(日本NihonKohden生產(chǎn))。所充內(nèi)液成分為(mmol/L):KCl(CsCl)140,CaCl21,MgCl22,HEPES10,EGTA11,ATP4,電極電阻2-4MΩ,灌流用外液成分為(mmol/L):NaCl150,CaCl22.5,KCl5,MgCl21,HEPES10,D-glucose10。在電極與細胞膜之間形成高阻(1～5MΩ)封接后,進一步將膜吸穿,調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補償,置鉗制電壓于-60MV,膜電流應(yīng)用低通濾波(10kHz,-3dB),電流直接描記于筆錄儀上。1.2疼痛行為反應(yīng)的研究1.2.1試驗進度及方法本研究所用動物為100～150g的SD雄性大鼠,均由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。全部試驗均在動物清醒狀態(tài)下進行。大鼠隨機以每6只為一組分組喂養(yǎng),室溫維持在(22±2)℃并遵循12∶12h的晝夜節(jié)律。試驗前一小時,隨機取一只動物放入一20cm×20cm×30cm有機玻璃制成的觀察箱內(nèi)讓動物熟悉試驗環(huán)境。試驗開始時,在后肢腳掌底部皮下注射測試藥物以誘導(dǎo)急性疼痛,然后立即放入觀察箱內(nèi)觀察、記錄痛行為反應(yīng)。以注藥側(cè)后肢的抬舉動作作為痛反應(yīng)的觀察、判斷指標(biāo),以后肢明顯抬離箱底的持續(xù)時間(s)作為測量依據(jù),以每5min為一時間節(jié)段,依據(jù)不同的實驗需要,每次試驗共觀察45min到55min不等。一般每只動物只試驗一次,如果兩側(cè)后肢均需使用,則前后兩次連續(xù)試驗的間隔時間為一周。試驗完畢后,將動物處死。1.2.2單次給藥劑量試驗把在觀察箱內(nèi)已熟悉試驗環(huán)境的大鼠誘入一布制口袋,讓其呼吸暢通,又能暴露后肢。當(dāng)動物平靜下來后即可用30G針頭將50μl試驗用藥注入單側(cè)后肢腳掌底部皮下。所用藥物均為Sigma公司生產(chǎn)。試驗前將5-Hydroxytryptamine(5-HT,serotonin)、Cyproheptadine(Cyp,5-HT2受體選擇性拮抗劑)、ICS205-930(5-HT3受體選擇性拮抗劑)和按試驗設(shè)計要求的搭配與濃度溶于細胞外液(pH7.4)。1.2.3術(shù)后毒副反應(yīng)的觀察首先觀察不同濃度的5-HT所引起的量-效關(guān)系。按不同濃度的5-HT分組進行試驗,每組動物不少于6只。本文試驗所用5-HT濃度為0.01,0.1和1.0mol/L。將5-HT(1.0mol/L)與Cyproheptadine(0.1μmol/L)或ICS(1.0mol/L)混合后注射于后肢掌底皮下,誘導(dǎo)并觀察和記錄相應(yīng)的痛行為反應(yīng)的變化。實驗前分別觀察、記錄單獨注射Cyp(0.1μmol/L)、ICS(1.0mol/L)和細胞外液后相應(yīng)的行為反應(yīng),以作為對照。1.3評估總抬實踐結(jié)果以注藥側(cè)后肢抬腿持續(xù)時間(s)為痛行為反應(yīng)的測試評估指標(biāo),以5min為一時間節(jié)段評估每時間節(jié)段內(nèi)的總抬腿時間(s)實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準誤(xˉ±sxˉ)(xˉ±sxˉ)來表示,兩組之間進行比較時采用t檢驗,由SAS統(tǒng)計軟件包在計算機上處理。2結(jié)果2.1激活電流s1在大鼠三叉神經(jīng)節(jié),大多數(shù)神經(jīng)細胞對5-HT敏感(61.4%,54/88),所引起的電流為快去敏感的內(nèi)向電流,此5-HT激活電流(I5-HT)具有明顯的濃度依賴性(10-6～10-3mol/L)。由于I5-HT(10-4mol/L)能被5-HT3受體特異性激動劑2-methyl-5-HT(10-4mol/L)所模擬,并可為5-HT3受體選擇性拮抗劑ICS-205930(10-5mol/L)所阻斷。因此,本文所記錄到的I5-HT被認為是5-HT3受體激活所介導(dǎo)的膜電流(圖1)。2.2濃度1.2.35-HT2受體激動劑α-methyl-5-HT(10-12～10-8mol/L)能濃度依賴性地增強5-HT(3×10-5mol/L)引起的膜電流,當(dāng)濃度超過10-8mol/L時,此增強效應(yīng)反而消失。而5-HT1R受體激動劑UH-301則無作用。2.35總抬實踐持續(xù)時間不同濃度的5-HT所誘導(dǎo)的痛行為反應(yīng)主要發(fā)生在注藥后20min內(nèi)。20min以后隨著5-HT的彌散和降解痛反應(yīng)已不明顯。為便于比較和統(tǒng)計,我們用前20min內(nèi)的總抬腿持續(xù)時間作為比較和統(tǒng)計依據(jù)。隨著5-HT濃度的逐漸增加(從10-5mol/L到10-3mol/L),痛行為反應(yīng)也明顯地增強(P<0.05),而后肢掌底皮下注射細胞外液則無明顯反應(yīng)(P<0.01,圖3)。2.4后注射側(cè)下肢抬/判斷后肢掌底皮下分別注射5-HT(10-3mol/L)、cyproheptadine(10-7mol/L)+5-HT(10-3mol/L)、ICS205930(10-3mol/L)+5-HT(10-3mol/L)以及作為對照單獨注射cyproheptadine(10-7mol/L)、ICS205930(10-3mol/L)和細胞外液(pH7.4)后注射側(cè)后肢抬腿反應(yīng)的時程變化?？梢钥闯?抬腿反應(yīng)主要集中在注射后頭10～15min內(nèi)(圖4)。注射藥物后前20min的總抬腿持續(xù)時間顯示并比較了不同試驗組的反應(yīng)強度的變化(圖5),其強度序列為:5-HT>5-HT+ICS>5-HT+CYP>CYP=ICS3-ht受體激動劑在組織損傷或炎癥時,5-HT由血小板、肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放出來而進入滲液中。5-HT作為致痛物質(zhì)而作用于外周神經(jīng)末梢通過5-HT受體引起傷害性感受,5-HT受體的作用通常是作為一個整體來研究的。本文的行為學(xué)實驗表明,后肢掌底皮下注射5-HT后的前20min累計抬腿時間是隨著5-HT的濃度增加(從10-5mol/L到10-3mol/L)而逐漸增加(圖2),這與其他學(xué)者的報道相吻合。關(guān)于5-HT對初級感覺神經(jīng)元作用的認識主要基于電生理學(xué)實驗資料。早期一些關(guān)于5-HT對外周神經(jīng)末梢作用的研究,例如:5-HT興奮皮膚初級傳入神經(jīng)元的外周末梢;5-HT去極化和激活初級感覺神經(jīng)元以及其它報道等都進行了探索。自從5-HT3受體被克隆并了解了其的特征后,現(xiàn)在已很清楚,5-HT激活的內(nèi)向電流主要由5-HT3受體介導(dǎo),該受體為配體門控離子通道受體(LGIC)。目前其它的5-HT受體亞型(均屬G蛋白偶聯(lián)受體)對I5-HT或5-HT3受體功能的作用有關(guān)的報道很少。本研究表明:5-HT2受體激動劑α-methyl-5-HT能明顯增強I5-HT,而5-HT1受體激動劑R-(+)-UH-301則無此作用。可以認為在5-HT激活初級傳入末梢時,5-HT3受體介導(dǎo)膜電流或去極化從而引起神經(jīng)元的興奮,而5-HT2受體僅起到調(diào)制5-HT3受體功能的作用。換句話說,在5-HT興奮初級傳入末梢時,5-HT3受體的激活在引發(fā)神經(jīng)末梢興奮上可能起主要作用,5-HT2受體則繼后發(fā)揮維持興奮和在調(diào)制方面起作用。我們觀察到,本文實驗中5-HT+ICS的致痛作用大于5-HT+CYP在痛行為反應(yīng)中的作用,而且即使5-HT3受體的作用被去除,5-HT所介導(dǎo)的痛反應(yīng)仍然存在。聯(lián)系到其他作者的發(fā)現(xiàn),我們試圖加以解釋在本實驗中所觀察到的現(xiàn)象。(1)在應(yīng)用ICS-205930消除5-HT3受體的作用后,5-HT誘導(dǎo)的痛反應(yīng)仍然存在。Tokunaga等有同樣的報道。我們認為,5-HT2受體本身并不能引發(fā)膜電流,但它能通過G蛋白偶聯(lián)和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強5-HT3受體的功能。(2)5-HT+CYP誘發(fā)的痛反應(yīng)比5-HT+ICS所誘發(fā)的痛反應(yīng)弱。通常,5-HT3受體被認為在5-HT誘導(dǎo)的痛反應(yīng)中起主要作用,因為5-HT能直接作用于5-HT3受體引發(fā)膜電流。但是,正如所見,I5-HT是快速內(nèi)向電流,僅起著瞬時或快速去極化作用,而傷害性信息的維持必需要依賴于其它的因素,如5-HT2受體。(3)如前所述,5-HT3受體引發(fā)的興奮啟動后,大多數(shù)