中國大胚胎發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)研究

中國大胚胎發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)研究

這兩類動(dòng)物是水生和陸地動(dòng)物的過渡生物。密切研究魚類和蝦的遺傳關(guān)系對研究魚類和比較胚胎的培養(yǎng)非常重要。目前，兩棲親生植物的研究主要集中在無尾和無尾的頭部上。蔡寶建立了一個(gè)基于東亞太經(jīng)轉(zhuǎn)化的短暫系統(tǒng)，并繪制了完整的形態(tài)和器官發(fā)育手冊。根據(jù)上科隱省亞系在美國的發(fā)育過程中留下的微生物群，只有三種：北美的大、日本的大和中國的大。關(guān)于中國大育種的研究僅限于對外觀的初步觀察，在大育種時(shí)期的分布尚不清楚，也缺乏對組織和器官發(fā)育的研究。近年來，作者的專業(yè)研究團(tuán)隊(duì)成功地對中國的大進(jìn)行了人工繁殖，并對中國的大進(jìn)行了連續(xù)、系統(tǒng)的形狀和力學(xué)觀察。新的認(rèn)識是在中國早期橢圓形破裂和器官發(fā)育的基礎(chǔ)上研究隱頭氏族其他物種和兩棲動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)展。1材料和方法1.1產(chǎn)卵的獲得和孵化中國大鯢人工催產(chǎn)及孵化是在本研究室大鯢人工繁育基地進(jìn)行的.已達(dá)性成熟親本通過人工催產(chǎn)、人工授精獲得受精卵.受精卵在地下室孵化池中流水孵化(水溫(20±1)℃,溶解氧(5±1)mg/L,pH值7.4—7.6),每日平均光照大約1h,照度為4lx.1.2體視鏡.體.觀觀察外形觀察的方法為:受精后-多細(xì)胞期,每2小時(shí)觀察記錄一次;囊胚期-尾芽期,約每8小時(shí)觀察記錄一次;鰓板期-孵化出膜,約12h觀察記錄一次.胚胎發(fā)育時(shí)期的確定基本上以同批胚胎1/2達(dá)到該時(shí)期為準(zhǔn),2003—2005年期間共觀察統(tǒng)計(jì)了1100余枚胚胎.組織學(xué)研究采用所拍照記錄的胚胎,具體方法為:卵裂階段每個(gè)時(shí)期取2枚胚胎;囊胚和原腸胚各取3枚胚胎;神經(jīng)胚各時(shí)期分別取2枚胚胎;器官形成階段每日取1—2枚胚胎.共取得大鯢胚胎56枚,早期胚胎采用Smith’s液固定,常規(guī)酒精-叔丁醇脫水,前肢芽期后的胚胎采用Bouin’s液固定,常規(guī)酒精脫水,石蠟包埋,切片(厚度6—10μm),常規(guī)HE染色.形態(tài)觀察及照像采用NikonSMZ800體視鏡攝像系統(tǒng),OlympusXTL-Ⅱ型照相機(jī)體視顯微照相系統(tǒng)和SonyR1數(shù)碼相機(jī);顯微切片觀察及照像采用NikonE600顯微圖像采集系統(tǒng).分期系統(tǒng)的建立依據(jù)中國大鯢胚胎發(fā)育各階段獲得的外形記錄及圖片,結(jié)合組織學(xué)切片結(jié)果,分析其外形變化及主要器官發(fā)生發(fā)育變化特征,并劃分具體發(fā)育時(shí)期.分期標(biāo)準(zhǔn)參考東方蠑螈和黑斑蛙的分期方法.2結(jié)果中國大鯢胚胎發(fā)育可分為6個(gè)階段,共20個(gè)發(fā)育時(shí)期(見表1).2.1卵裂及裂裂面的特征中國大鯢卵子大多直徑為5—8mm,不含色素,卵黃含量非常豐富,卵子呈卵黃色,動(dòng)物極附近顏色稍淺.卵子外裹有膠膜,入水后膠膜吸水膨脹,卵周隙明顯擴(kuò)大.受精后20h左右,動(dòng)物極出現(xiàn)一條分裂溝,第一次卵裂開始.第一次卵裂為經(jīng)裂(圖1(a)),分裂溝在動(dòng)物極端較深,隨著分裂進(jìn)行,分裂溝緩慢地向下延伸并越來越淺,越過赤道面后消失在植物半球,第一次分裂完成大約需要4—8h.第二條分裂溝在第一條分裂溝出現(xiàn)大約2h后出現(xiàn),第二次分裂亦為經(jīng)裂,與第一次分裂面垂直(圖1(b)).第三次卵裂仍為經(jīng)裂,并且有兩個(gè)相互垂直的經(jīng)裂面.前三次分裂在動(dòng)物極端呈現(xiàn)“米”字形(圖1(c)),隨后的第四次分裂為緯裂,分裂面靠近動(dòng)物極頂端,并且分裂在各個(gè)卵裂球不是同時(shí)進(jìn)行的,分裂速度出現(xiàn)明顯差異,細(xì)胞的排列也不規(guī)則.在最初的幾次分裂中,動(dòng)物半球每隔2—4h就會(huì)產(chǎn)生一條分裂溝,之后胚胎的分裂速度逐漸加快,分裂溝在動(dòng)物半球越來越多,在植物半球只能依稀看見數(shù)條淺分裂溝.2.2細(xì)胞裂裂率測定從第三天開始胚胎發(fā)育進(jìn)入囊胚期.囊胚期胚體呈球狀(圖1(e),(f)),在近動(dòng)物極端出現(xiàn)一個(gè)大的空腔,此即囊胚腔(圖2(a)),在植物半球可見較多呈龜裂狀分裂溝.囊胚腔頂端的細(xì)胞界限不清晰,但可見細(xì)胞核,卵黃顆粒也較細(xì)密,卵黃含量較少;囊胚腔底端植物半球細(xì)胞大,可見細(xì)胞核(圖2(b)),周圍卵黃密布.2.3原腸期的發(fā)育從第六天開始,胚胎赤道面稍下方出現(xiàn)一道淺的橫溝,溝的上方為背唇(圖1(g),(h);圖2(c)),胚胎發(fā)育進(jìn)入原腸期.在接下來的幾天里,背唇由短的淺溝逐漸拉長成為大圓弧,原腸腔擴(kuò)大囊胚腔消失(圖2(e)),胚軸逐漸轉(zhuǎn)動(dòng).圓弧形的胚孔最后合并為環(huán)狀(圖1(i)),中間充塞著大的卵黃栓,受精后10d左右卵黃栓轉(zhuǎn)至尾部慢慢縮小,并在神經(jīng)管閉合時(shí)消失.2.4舉出現(xiàn)神經(jīng)褶神經(jīng)板期:胚胎背部出現(xiàn)前端寬大、后端細(xì)長的勺狀神經(jīng)板(圖1(j);圖2(f)),神經(jīng)板及其周圍的組織依然含有豐富的卵黃(圖2(g)).神經(jīng)褶期:神經(jīng)板邊緣高舉出現(xiàn)神經(jīng)褶(圖1(k);圖2(h)).在神經(jīng)褶期的稍晚階段出現(xiàn)體節(jié),大約6—8對.神經(jīng)褶細(xì)胞中充斥著大量卵黃(圖2(i)).神經(jīng)褶沿胚胎背中部匯聚中間下陷,彼此黏附、融合形成中空的神經(jīng)管.神經(jīng)管期:神經(jīng)管閉合(圖1(m)),胚胎在膠膜內(nèi)開始側(cè)臥.神經(jīng)管頭部膨大離開卵面突出,并出現(xiàn)凸凹不平的隆起;體節(jié)大約10—12對,體節(jié)下方出現(xiàn)腎原基.神經(jīng)管頭部可見視泡、前腦和后腦(圖2(j));稍后部位可見咽、咽囊、脊索和腎管(圖2(k));胚胎后端的腸呈現(xiàn)細(xì)長條狀(圖2(l)).2.5監(jiān)結(jié)果圖12尾芽期:胚胎頭部顯著膨大,肉眼可分辨出眼泡,并且由于腦的發(fā)育,整個(gè)神經(jīng)管伸長較快,因此產(chǎn)生彎曲,腦部向下彎曲約成90°角,成為腦曲,尾部形成尾芽并離開卵面突出(圖1(n));心臟原基出現(xiàn)(圖2(m)).鰓板期:眼泡突出,周圍凹陷;鰓板原基隆起逐漸分化為鰓弓(圖1(o);圖2(n));胸腔更加膨大,心臟分化為心房和心室(圖2(o));體節(jié)24對;體表尤其是背部區(qū)域出現(xiàn)色素斑點(diǎn);尾芽末端細(xì)圓.前肢芽期:前肢芽出現(xiàn)原基;鰓板部位分化出3對短小的外鰓芽(圖1(p),(q);圖3(c),(d),(f));胸腔透明化,心臟淺色并開始跳動(dòng),每分鐘25次左右;胚體可以緩慢扭動(dòng).視杯、晶狀體、嗅窩出現(xiàn)(圖3(a));聽囊、中腦、菱腦、腦神經(jīng)節(jié)出現(xiàn),甲狀腺出現(xiàn),脊索開始空泡化,肝臟出現(xiàn)(圖3(b),(c),(e)).3對外鰓芽增長并長出分枝;體色素增多;心律30—40;同時(shí)富含卵黃的腹部細(xì)胞分裂加快,可見眾多細(xì)胞核(圖3(g)).鰓血循環(huán)期:心臟-外鰓的循環(huán)開始,心率40—50;頭部及外鰓發(fā)達(dá)(圖1(s);圖3(h),(i))每根外鰓芽上分出3—5對分枝,可以觀察到透明的毛細(xì)血管中有紅細(xì)胞流動(dòng);腹部出現(xiàn)網(wǎng)狀血管分布;眼出現(xiàn)少許色素,頭部、背部的色素成片分布(圖1(r),(s)).鰓血循環(huán)晚期時(shí),心率50—55;每根鰓芽分枝5—8對;眼色素連成環(huán)狀,腹部色素增多;前肢芽呈現(xiàn)尖細(xì)狀;下頜及胃出現(xiàn)(圖3(j)).尾血循環(huán)期:可見明顯尾部血液循環(huán);下頜裂延長,可以活動(dòng);腦壁增厚,晶狀體變透明,體色素在腹部廣泛分布(圖1(t);圖3(k),(l)).此階段的幼苗肌肉、骨骼發(fā)達(dá),運(yùn)動(dòng)頻繁,常提前脫膜.該時(shí)期脫膜的幼鯢存活率較高,而在此時(shí)期之前出膜的幼苗大部分死亡.2.6出膜前后兩外分布受精后歷經(jīng)31d,每根外鰓上有6—8對鰓絲分枝,呈羽狀,心率每分鐘約55次;頭背部色素、血管密布,呈現(xiàn)黑紅色;腹部卵黃細(xì)胞區(qū)有一半?yún)^(qū)域出現(xiàn)色素;后肢芽出現(xiàn)并伸長,皮膚腺(圖3(m))、肛門出現(xiàn)(圖1(u);圖3(n),(o));前肢芽增長增粗亦出現(xiàn)色素,出膜前后分為兩趾;眼黑亮;背鰭寬大,尾鰭狹長.胚胎膠膜松散并膨脹,幼鯢不斷扭動(dòng),頭部突破膠囊最后完全脫膜.剛出膜的幼苗長約3.5cm,背部黑褐色,腹部細(xì)胞仍然含有豐富卵黃,外鰓發(fā)達(dá)每側(cè)長約1cm,無平衡棒,無口吸盤.靜止時(shí)平臥或側(cè)臥于水底,依靠尾部擺動(dòng)可以平游.孵化出膜后大約一個(gè)月,中國大鯢幼苗前后肢的伸長、分趾逐漸完成,腹部卵黃也會(huì)消耗殆盡.隨著生長發(fā)育,肺也逐漸發(fā)育,外鰓在出膜后大約8個(gè)月開始萎縮,最終完全消失而由肺成為唯一的呼吸器官大約需要1—2年的時(shí)間.3討論3.1中國大早期胚胎發(fā)育卵裂的細(xì)胞界限之前有報(bào)道認(rèn)為:中國大鯢卵子受精后形成白色帽狀胚盤,分裂僅限于胚盤,屬于典型的盤狀卵裂.作者近三年對大鯢早期胚胎的觀察發(fā)現(xiàn):中國大鯢卵子受精后,并未見明顯的胚盤樣隆起.受精卵分裂時(shí),分裂溝自動(dòng)物極端向下延伸至植物半球.在囊胚期的植物半球上可觀察到一些淺龜裂狀的分裂溝,這一現(xiàn)象曾有過報(bào)道.中國大鯢胚胎沒有出現(xiàn)卵黃囊結(jié)構(gòu),囊胚腔頂壁細(xì)胞中含有大量的卵黃,囊胚腔下方植物半球中可見許多細(xì)胞核.同時(shí),在神經(jīng)胚、尾芽期、鰓板期和前肢芽期胚胎的外胚層來源細(xì)胞中均存在有豐富的卵黃顆粒.盤狀卵裂類型的分裂溝局限于胚盤,卵黃不參與胞質(zhì)的分割.觀察結(jié)果表明,中國大鯢早期胚胎發(fā)育卵裂類型不是盤狀卵裂,而與黑斑蛙、東方蠑螈的不等全裂方式更為相似.在中國大鯢早期胚胎切片中,特別在那些卵黃很豐富的組織中,細(xì)胞界限不清晰,只能觀察到大量的細(xì)胞核.我們注意到,那些卵黃較少的外胚層組織比較容易分辨細(xì)胞界限,而隨著卵黃持續(xù)消耗,那些原本分界模糊的內(nèi)胚層來源的組織其細(xì)胞界限也逐漸清晰起來.然而中國大鯢早期胚胎細(xì)胞界限不清晰究竟是因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)中卵黃對細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察的影響,抑或是由于豐富卵黃對分裂面的阻遏作用,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的分裂滯后于核分裂,還需要進(jìn)一步的深入研究.中國大鯢第一、二次卵裂均為經(jīng)裂,第三次卵裂仍為經(jīng)裂,第四次卵裂為不規(guī)則的緯裂.這與黑斑蛙與東方蠑螈前兩次卵裂是經(jīng)裂,第三次卵裂則為緯裂,第四次分裂是經(jīng)裂存在著明顯差異.施氏鱘(AcipenserSchrenckii)是一種以不等全裂方式進(jìn)行卵裂的硬骨魚類,施氏鱘前三次卵裂為經(jīng)裂,第四次為緯裂,劉洪柏等認(rèn)為施氏鱘的這種卵裂方式是介于魚類和兩棲類之間的一種過渡類型.中國大鯢與施氏鱘早期卵裂過程十分相似,表明中國大鯢在進(jìn)化上可能與硬骨魚類存在有密切關(guān)系.在20℃水溫下,從受精卵發(fā)育至囊胚早期多數(shù)硬骨魚類僅3h,黑斑蛙約6h,東方蠑螈約24h,而中國大鯢則需要約70h.中國大鯢早期胚胎細(xì)胞分裂速度非常緩慢,從而導(dǎo)致整個(gè)胚胎發(fā)育持續(xù)時(shí)間長(約700h).在中國大鯢人工繁育生產(chǎn)實(shí)踐中,控制孵化溫度、孵化密度,提高溶氧量,保持水體清潔和防止微生物侵染是提高中國大鯢孵化率的一個(gè)重要保證.3.2體外受精神養(yǎng)血及體外為體的體理特征中國大鯢在腦的分化,眼、嗅窩、聽囊、腎管和生殖嵴的發(fā)生發(fā)育過程上與東方蠑螈基本相同(圖4).在鰓板期二者都出現(xiàn)了心房心室,心臟搏動(dòng)血液循環(huán)也都是在前肢芽早期開始的,但中國大鯢心臟原基的出現(xiàn)要稍稍晚于東方蠑螈.中國大鯢在消化系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育上與東方蠑螈存在有較大的差異:東方蠑螈在神經(jīng)管期、尾芽期和鰓板期分化出咽、肝臟和甲狀腺,并且形成了肛門;而中國大鯢在神經(jīng)管期有咽和腸的形成,在此之后的較長時(shí)間內(nèi)消化道沒有明顯發(fā)育變化,直到前肢芽期才形成肝臟和甲狀腺,孵化期出現(xiàn)肛門.中國大鯢胚胎消化系統(tǒng)發(fā)育緩慢的特點(diǎn)可能與其胚胎細(xì)胞含有豐富的卵黃密切相關(guān).孵化出膜中國大鯢幼苗的組織細(xì)胞中仍然含有大量卵黃,這些卵黃的存在為胚后發(fā)育提供營養(yǎng).大鯢幼苗細(xì)胞中的卵黃大約在孵化出膜后30d左右消耗殆盡,此時(shí)消化系統(tǒng)也已基本發(fā)育完善,方可開始投喂餌料.剛孵化的大鯢幼苗雖然已經(jīng)開口、具有吞咽食物的能力,但若立即喂食,則會(huì)導(dǎo)致幼苗死亡.大多數(shù)兩棲動(dòng)物胚胎孵化后在其頭部發(fā)生一類臨時(shí)性的器官:東方蠑