組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶修飾型人源載體的構(gòu)建及其功能研究的任務(wù)書

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶修飾型人源載體的構(gòu)建及其功能研究的任務(wù)書任務(wù)書一、任務(wù)背景組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histoneacetyltransferase，簡稱HAT）是一種酶類，能夠催化組蛋白上乙?；揎椀姆磻?yīng)，從而影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，在表觀基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。組蛋白乙?；揎椏梢越档腿旧|(zhì)緊密包結(jié)程度，使得基因轉(zhuǎn)錄因子能夠去到依賴性的DNA序列并啟動轉(zhuǎn)錄，還可以招募一些輔助蛋白質(zhì)，搭建一些表觀基因調(diào)控復合物，對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA復制和修復等過程都有影響。本任務(wù)將利用HAT在表觀基因調(diào)控中的重要機制，構(gòu)建修飾型人源載體，從而探究HAT對人基因表達的影響以及在免疫疾病等方面的應(yīng)用前景，研究內(nèi)容涵蓋基因克隆、細胞培養(yǎng)、蛋白表達和功能鑒定等方面。二、任務(wù)目標1.設(shè)計并合成帶有HAT修飾基團的修飾型人源載體，實現(xiàn)對人基因表達的調(diào)控，為免疫疾病的研究提供潛在工具。2.利用HAT修飾型人源載體，進行細胞轉(zhuǎn)染、蛋白表達、蛋白純化等基本技術(shù)操作，獲取相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。3.對HAT對基因表達的影響進行研究，探明其表觀基因調(diào)控機制，為HAT基因在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中提供理論支持。三、任務(wù)內(nèi)容1.設(shè)計修飾型人源載體并合成。（1）根據(jù)HAT修飾機制、人源基因序列等信息，設(shè)計包含特定基團的修飾型人源載體模板，包括攜帶融合標簽(如6xHis-tag、Flag-tag或Myc-tag等)的載體,以及攜帶啟動子和終止子的載體;（2）利用PCR、酶切、質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化等基本分子生物學技術(shù)，構(gòu)建所設(shè)計的修飾型人源載體;（3）進行質(zhì)粒鑒定，確認所構(gòu)建的修飾型人源載體正確。2.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。（1）培養(yǎng)CHO或HEK293等哺乳動物細胞系，維持在恰當?shù)臈l件下進行，比如控制pH值、溫度、CO2濃度等因素;（2）利用所構(gòu)建的修飾型人源載體對細胞進行轉(zhuǎn)染操作，通過fluorescenceactivatedcellsorting(FACS)篩選出正常表達HAT基因的細胞群體，提高實驗效率。3.蛋白表達和純化。（1）收集經(jīng)過FACS篩選的正常表達HAT基因的細胞，利用真核表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達HAT蛋白;（2）純化HAT蛋白，利用蛋白層析技術(shù)純化表達的HAT蛋白;（3）對純化的HAT蛋白進行質(zhì)量檢測、SDS電泳分析等.4.功能鑒定。（1）構(gòu)建一組對照組和實驗組，對相應(yīng)細胞和蛋白樣品進行研究;（2）利用qRT-PCR、Westernblotting等多種技術(shù)，比較對照組和實驗組在基因表達方面的差異;（3）將差異表達的分子或蛋白鑒定出來，分析其與全基因組中的哪些基因有所聯(lián)系，從而初步探明HAT對表觀遺傳水平調(diào)控的可行性。四、任務(wù)成果1.修飾型人源載體的構(gòu)建方案及所構(gòu)建的質(zhì)粒分子圖譜。2.正常表達HAT蛋白的細胞群體，包括FACS篩選和細胞培養(yǎng)過程的數(shù)據(jù)和圖片。3.HAT蛋白的表達和純化方案及所純化的蛋白的電泳數(shù)據(jù)和質(zhì)量檢測結(jié)果。4.基于HAT蛋白的功能鑒定實驗數(shù)據(jù)，包括差異表達基因或蛋白等實驗結(jié)果,以及基因功能分析等.五、參考文獻1.ChenX,etal.（2018）HistoneAcetylation:APotentialNewTargetforthePreventionandTreatmentofInsulinResistance.JDiabetesRes.2.Zorina-LichtenwalterK,etal.(2019)HistoneAcetyltransferasesandDeacetylases:MolecularandClinicalImplicationstoOrofacialGranulomatosisandChronicInflammatoryDiseases.FrontImmunol.3.Wang,H,etal.(2020)Reactivationofexpressionthroughhistoneacetylation:apromisingapproachforcancerimmunotherapy.CellMolImmunol.4.GuoR,etal.(2017)HumanendogenousretrovirusKGagcoassembleswithHIV-1GagandreducesthereleaseefficiencyandinfectivityofHIV-1.JViro