生化藥物和基因工程藥物分析概念

第十三章

生化藥物和基因工程藥物分析概念1精選課件1、了解生化藥物、基因工程藥物的定義、種類。2、熟悉質(zhì)量檢驗(yàn)的根本程序與方法。3、掌握生化藥物、基因工程藥物的特點(diǎn)及常用的化學(xué)定量分析方法。本章學(xué)習(xí)要點(diǎn)2精選課件人類用于預(yù)防、治療和診斷疾病的三大主要藥物第一節(jié)概述化學(xué)藥物生物藥物中藥3精選課件生物藥物的定義：利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制得的一大類藥物。4精選課件生物藥物的分類：生化藥物生物技術(shù)藥物生物制品從生物體別離純化制得的生化根本物質(zhì)，以及用化學(xué)合成、微生物合成或現(xiàn)代生物技術(shù)制得的一類藥物。利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術(shù)體系即現(xiàn)代生物技術(shù)研制的藥物稱之。應(yīng)用普通的或基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。5精選課件一、生化藥物和基因工程藥物的定義1、生化藥物的定義從動(dòng)物、植物及微生物提取的，也可用生物－化學(xué)半合成或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命根本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等。6精選課件2、基因工程藥物的定義先確定對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白質(zhì)合成過(guò)程的基因進(jìn)行別離、純化或人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最后將該基因?qū)肟梢源罅可a(chǎn)的受體細(xì)胞中不斷繁殖或表達(dá)，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過(guò)這種方法生產(chǎn)的藥物稱之。7精選課件1、氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類藥物二、生化藥物和基因工程藥物的種類〔一〕生化藥物的種類〔1〕氨基酸及其衍生物：①單氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸等。8精選課件②氨基酸衍生物：N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羥色氨酸。③復(fù)合氨基酸注射液：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復(fù)合氨基酸注射液?！睸代表氨基酸的種類〕9精選課件〔2〕多肽類藥物：①垂體多肽：促腎上腺皮質(zhì)激素、促胃液素、加壓素。②消化道多肽：促胰液素〔胰泌素〕、胃泌素、抑胃肽。③下丘腦多肽：促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素釋放激素、生長(zhǎng)激素釋放激素。10精選課件④腦多肽：由人及動(dòng)物腦和腦脊液中別離出來(lái)的多肽、蛋氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽等。⑤激肽類：血管緊張肽I、II、III等活性肽。⑥其它肽類：谷脫甘肽、降鈣素、睡眠肽、松果肽、血活素〔分子量為3000的肽為主成分)。11精選課件〔3〕蛋白類藥物豬或牛的纖維蛋白原、纖維蛋白、胃膜素〔糖蛋白〕、水蛭素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；屬蛋白質(zhì)類激素尚有生長(zhǎng)素、催乳素、促甲狀腺素、促泡激素〔FSH〕、促黃體激素〔LH〕；植物來(lái)源的蛋白類藥物有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。12精選課件2、酶類藥物〔1〕助消化酶類：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麥芽淀粉酶?！?〕蛋白水解酶類：溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶。〔3〕凝血酶及抗栓酶：凝血酶〔豬、牛血〕、纖溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。13精選課件〔4〕抗腫瘤酶類：L-天門(mén)冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、組氨酸酶、谷氨酸胺酶。〔5〕其它酶類：細(xì)胞色素C、超氧化物歧化酶〔SOD〕、RNA酶、青霉素酶?！?〕輔酶：CoA、黃素單核苷酸〔FMN〕、黃素腺嘌呤二核苷酸〔FAD〕。14精選課件3、多糖類藥物〔1〕肝素、硫酸軟骨素A和C、硫酸皮膚素〔硫酸軟骨素B〕、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸等?！?〕類肝素〔酸性粘多糖〕、鹿茸多糖、殼聚多糖、右旋糖苷、靈芝多糖、豬苓多糖、人參多糖、黃芪多糖等。15精選課件4、脂質(zhì)類藥物卵磷脂、腦磷脂、膽固醇、麥角固醇、B谷固醇、膽汁酸〔膽酸與甘氨酸或牛黃酸的結(jié)合物〕、鵝脫氧膽酸、膽紅素、原葉琳、血葉琳、亞油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列〔PGE1、PGE2、PGE2a和PG12〕。16精選課件5、核酸類藥物RNA〔包括iRNA-免疫核糖核酸〕、DNA〔脫氧核糖核酸〕、聚肌苷酸、巰基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷。此外，有核酪制劑，6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷等。17精選課件二、基因工程工藥物的種類1、激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物〔1〕人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子〔2〕人胰島素〔3〕人生長(zhǎng)激素2、細(xì)胞因子類藥物〔1〕人干擾素18精選課件〔2〕人白細(xì)胞介素〔3〕集落刺激因子〔4〕促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素3、酶類及凝血因子類藥物單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、白介素、生長(zhǎng)因子、反義藥物、腫瘤壞死因子等。19精選課件1、共同特點(diǎn)：具有一定的生物活性或生理功能，能夠參與、影響和調(diào)控人體代謝和生理功能，對(duì)于某些疾病的治療具有針對(duì)性強(qiáng)、毒副作用小、易為人體所吸收等特點(diǎn)。三、生化藥物和基因工程藥物的特點(diǎn)20精選課件2、分子量不是定值除氨基酸、核苷酸、輔酶及甾體激素等屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物外，大局部為大分子物質(zhì)，其分子量一般幾千至幾十萬(wàn)。對(duì)大分子的藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。21精選課件3、結(jié)構(gòu)確證難在此類藥物中，由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)確實(shí)證很難沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以證實(shí)，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實(shí)。22精選課件4、全過(guò)程的質(zhì)量控制此類藥物對(duì)熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，需對(duì)原材料、生產(chǎn)過(guò)程和最終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。23精選課件5、生物活性檢查在制備多肽或蛋白質(zhì)類藥物時(shí)，有時(shí)因工藝條件的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。因此，除了用通常采用的理化法檢驗(yàn)外：尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定，以證實(shí)藥物的生物活性。

24精選課件6、平安性檢查由于此類藥物性質(zhì)特殊，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物，故常需做平安性檢查。7、效價(jià)測(cè)定對(duì)酶類藥物需進(jìn)行效價(jià)測(cè)定或酶活力測(cè)定，以說(shuō)明其有效成分含量的上下。25精選課件第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的根本程序與方法一、鑒別試驗(yàn)〔一〕理化鑒別法利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法來(lái)確證生化藥物的真?zhèn)?。用?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。26精選課件1、化學(xué)反響法通常利用藥物與某試劑在一定條件下反響，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法；胃蛋白酶的鑒別采用沉淀法。2、HPLC法27精選課件3、UV法三磷酸腺苷二鈉的分子中具有共軛系統(tǒng)，能吸收紫外光。本品的0.01mol／L鹽酸水溶液〔20μg／ml〕，在〔257±1〕nm的波長(zhǎng)處有最大吸收。A250nm／A260nm的值應(yīng)為0.17～0.27。28精選課件〔二〕生化鑒別法1、酶法：尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解酶，根據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而具有相同作用的鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作為判斷指標(biāo)。29精選課件2、電泳法肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場(chǎng)作用下，向正極方向移動(dòng)，與肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置應(yīng)相一致。30精選課件3、樣品脫鹽后等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定測(cè)定藥物的等電點(diǎn)〔為出現(xiàn)多條區(qū)帶多個(gè)等電點(diǎn)〕，同批次同一產(chǎn)品的等電點(diǎn)應(yīng)相同，說(shuō)明其工藝穩(wěn)定?！踩成镨b別法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)鑒別藥物。31精選課件二、雜質(zhì)檢查〔一〕一般雜質(zhì)檢查檢查工程包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及枯燥失重、熾灼殘?jiān)取?2精選課件〔二〕特殊雜質(zhì)檢查許多藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。1、原料藥的純度分析2、生產(chǎn)過(guò)程中雜質(zhì)檢查33精選課件三、平安性檢查〔一〕熱原檢查法〔家兔、鱟試劑〕〔二〕異常毒性試驗(yàn)：用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反響。反響的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。34精選課件〔三〕過(guò)敏試驗(yàn)〔檢查異性蛋白〕藥物中假設(shè)夾雜有異性蛋白，在臨床使用時(shí)易引起病人多種過(guò)敏反響，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴(yán)重者可出現(xiàn)窒息、發(fā)結(jié)、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。35精選課件〔四〕降壓物質(zhì)檢查法降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。來(lái)源：用動(dòng)物臟器或組織為原料制備生化藥物，正常組織內(nèi)存在的組胺及局部氨基酸脫羧形成的組胺、酪胺等膠類物質(zhì)。36精選課件〔五〕無(wú)菌檢查法〔檢查活菌〕由于許多藥物是在無(wú)菌條件下制備的，且不能高溫滅菌。因此，無(wú)菌檢查就更有必要。中國(guó)藥典中幾乎所有的注射用藥如注射用尿激酶等，均做無(wú)菌檢查。37精選課件1、無(wú)菌檢查的根本步驟：①培養(yǎng)基的制備，為細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖提供所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)─碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。②選擇對(duì)照用菌液，供對(duì)照試驗(yàn)用。③具體檢查，如接種、培養(yǎng)等操作。④結(jié)果判斷，得出陰性或陽(yáng)性的結(jié)論。38精選課件2、本卷須知：①無(wú)菌檢查的全部過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作法，包括對(duì)操作環(huán)境、試驗(yàn)材料及用具酶滅菌等，防止微生物污染。②應(yīng)防止在有抑菌條件下操作。③從事無(wú)菌操作人員應(yīng)具備微生物學(xué)的根底知識(shí)及一定工作經(jīng)驗(yàn)，否那么要經(jīng)過(guò)無(wú)菌技能的培訓(xùn)，方能從事此工作。39精選課件〔六〕基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查可能雜質(zhì)：殘留DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素等；主要污染物：微生物、熱原、病毒等。主要檢查工程：外源性DNA、其他外源性雜質(zhì)測(cè)定40精選課件〔七〕致突變?cè)囼?yàn)包括：微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、嚙齒動(dòng)物微核試驗(yàn)等?！舶恕成扯拘栽囼?yàn)包括：一般生殖毒性試驗(yàn)、圍生期毒性試驗(yàn)。41精選課件四、含量〔效價(jià)〕測(cè)定含量表示方法百分含量，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。生物效價(jià)或酶活力，適用于酶類、蛋白質(zhì)類等藥物。42精選課件〔一〕含量測(cè)定1、HPLC法2、SDS法〔二〕效價(jià)測(cè)定：采用國(guó)際或國(guó)家參考品，或經(jīng)國(guó)家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參考品，以體內(nèi)或體外法測(cè)定其生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。43精選課件第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)用一、理化法〔一〕化學(xué)分析法1、重量法：根據(jù)樣品中別離出的單質(zhì)或化合物的重量測(cè)定所含成分的含量?！?〕提取法〔2〕揮發(fā)法〔3〕沉淀法44精選課件〔二〕電化學(xué)分析法離子選擇性電極：測(cè)量離子活度的指示電極。2、滴定分析法：根據(jù)樣品中某些成分與標(biāo)準(zhǔn)溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化復(fù)原或絡(luò)合反響等進(jìn)行測(cè)定。45精選課件〔三〕光譜分析法1、比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反響，依顏色反響的強(qiáng)度測(cè)定含量。如蛋白質(zhì)的含量測(cè)定，可利用蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反響，而進(jìn)行定量測(cè)定。46精選課件2、UV法：樣品或轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物在某一波長(zhǎng)處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸收度成正比，那么可進(jìn)行定量測(cè)定。如蛋白質(zhì)在280nm左右有最大吸收。3、熒光分光光度法：根據(jù)物質(zhì)被UV光照射后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定。47精選課件〔四〕色譜分析法1、HPLC法〔1〕RP-HPLC法：適用于肽類、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖的測(cè)定，如生白能。固定相：C8、C18烷基硅烷鍵合相流動(dòng)相：甲醇-水、乙腈-水〔甲醇〕、乙腈-緩沖液48精選課件〔2〕高效離子交換色譜法〔HPIEC〕HPIEC特點(diǎn)如下：①蛋白質(zhì)、多肽的別離是根據(jù)其相應(yīng)的離子化程度而進(jìn)行的。②別離過(guò)程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進(jìn)行的③柱效中等并具較高質(zhì)量的活性回收。49精選課件〔3〕高效凝膠過(guò)濾色譜法〔HPGFC〕HPGFC特點(diǎn)如下：①活性蛋白質(zhì)可得以回收。②別離是在固定比例的水溶液中進(jìn)行的。③別離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的。50精選課件2、高效毛細(xì)管電泳法〔HPCE〕HPCE是根據(jù)帶電組分在管中由于其所帶電荷和分子量的大小，即荷質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而別離。51精選課件類型酶活力測(cè)定法：以酶為分析對(duì)象，測(cè)定樣品中某種酶的活力或活性，并用活力單位和比活性表示

。酶分析法：以酶為分析工具或分析試劑，測(cè)定樣品中酶以外的其它物質(zhì)的含量。二、酶法52精選課件〔一〕酶活力測(cè)定法1、定義：酶活力是指酶催化一定化學(xué)反響的能力。酶活力的測(cè)定實(shí)際上是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反響的速度─可以用單位時(shí)間反響底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示。53精選課件2、方法〔1〕終點(diǎn)法：在適當(dāng)?shù)臈l件下，把酶和底物混合，測(cè)定生成一定量產(chǎn)物所需的時(shí)間。〔2〕將酶和底物混合后隔一定時(shí)間，間斷地或連續(xù)地測(cè)定反響的連續(xù)變化。54精選課件〔3〕將酶與底物混合后，讓其反響一定時(shí)間，然后停止反響，定量測(cè)定底物減少或產(chǎn)物生成的量。55精選課件〔二〕酶分析法1、動(dòng)力學(xué)分析法：通過(guò)條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反響中起決定反響速度的主導(dǎo)作用。那么酶的反響速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，通過(guò)測(cè)定酶反響速度即可求出它們的濃度。56精選課件2、總變量分析法〔平衡法或終點(diǎn)法〕：根據(jù)被測(cè)物質(zhì)〔底物〕的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行作用，在反響完成后，借助理化方法測(cè)出其總變化量，并參考反響的平衡點(diǎn)，計(jì)算出被測(cè)物的實(shí)際含量或濃度。57精選課件三、電泳法〔一〕根本原理電泳法是指帶電微粒如蛋白質(zhì)、核苷酸、其他微粒分子或離子在電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度泳動(dòng)而使組分別離，再進(jìn)行檢測(cè)或計(jì)算