DB2308T 182-2023稻瘟病菌無毒基因檢測PCR法技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.20DB23佳木斯市市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB2308/T182—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省佳木斯市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件由黑龍江省佳木斯市市場監(jiān)督管理局批準(zhǔn)發(fā)布。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所。本文件主要起草人：陸文靜、周通、王桂玲、周雪松、韓笑。本文件2023年首次發(fā)布。1DB2308/T182—2023稻瘟病菌無毒基因檢測PCR法技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）無毒基因檢測PCR法技術(shù)規(guī)范。包括分子檢測原理、儀器設(shè)備、試劑及樣品、防污染措施、實(shí)驗步驟及結(jié)果分析。本文件適用于黑龍江省佳木斯地區(qū)水稻稻瘟病菌無毒基因AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita、AVR-Piz-t、AVR-Pia、AVR-Co39的PCR檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗室技術(shù)要求3術(shù)語和縮略語下列術(shù)語和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1正向引物：處于DNA雙鏈上游的引物，簡稱F引物。3.2反向引物：處于DNA雙鏈下游的引物，簡稱R引物。3.3DNA：Deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸。3.4PCR：PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2DB2308/T182—20233.5Goldenview：核酸染料，替代溴化乙錠。3.6DNAMarker：標(biāo)準(zhǔn)分子量的核酸標(biāo)記。4原理提取稻瘟病菌菌絲DNA，根據(jù)無毒基因保守區(qū)域序列設(shè)計特異性引物，對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)序列比對結(jié)果，依據(jù)是否擴(kuò)增得到預(yù)期的DNA片段大小的序列來判斷樣品是否攜帶該無毒基因。5儀器設(shè)備電子天平、瓷質(zhì)研缽、研杵、移液槍、水浴鍋、高速離心機(jī)、核酸濃度測定儀（NanoDrop2000）、基因擴(kuò)增儀、瓊脂糖電泳槽及電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，其它相關(guān)儀器設(shè)備。6試劑及樣品干燥的稻瘟病菌絲0.05g～0.1g、10%CTAB、5MNaCl、0.5MEDTA（pH8.0）、1MTris（pH8.0）、1×TE緩沖液、氯仿：異戊醇（24：1）、75%乙醇、Goldenview等。除非另有說明，僅使用分析純試劑和ddH2O或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。7實(shí)驗過程防污染措施檢測過程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。8實(shí)驗步驟8.1稻瘟病菌菌絲DNA提取取單孢培養(yǎng)后烘干的菌絲0.1g于研缽中加入液氮用研杵研磨，菌粉轉(zhuǎn)入2mL滅菌離心管，并加入65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液700μL，蓋蓋混勻，置于水浴鍋內(nèi)65℃溫浴1h（期間間隔15min搖動混勻，使DNA提取緩沖液與菌絲充分混合，保證菌絲DNA的提取效率）。12000r/min離心10min，取上清液600μL置于新的2mL離心管，加入等體積氯仿：異戊醇（24﹕1）振蕩抽提5min~10min，12000r/min離心10min。緩慢吸取上清液500μL置于新的1.5mL離心管，加入等體積氯仿：異戊醇（24﹕1）振蕩抽提5min～10min，12000r/min離心10min。緩慢吸取上清液300μL于新的1.5mL離心管，加入900μL、-20℃預(yù)冷的無水乙醇，-20℃放置10min，12000r/min離心10min。3DB2308/T182—2023倒掉上清液，用75%乙醇洗滌沉淀3次，干燥后加入100μL1×TE緩測定提取DNA濃度，并用1×TE緩沖液稀釋至100ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2PCR反應(yīng)8.2.1將DNA、PrimeSTARBuffer（5×)、dNTPMixture、正向引物（F）及反向引物（R）及ddH2O置于冰上融化，引物序列參考附錄A。8.2.2在0.2mL加蓋無菌離心管中，按先后順序加入以下試劑：PrimeSTARBuffer（5×)dNTPMixture（2.5mM）2.4μL正向引物及反向引物（100nM）0.2μL（終濃度：0.2μM～0.3μM）樣本DNA1μL（20-100ng）ddH2OPrimeSTARHSDNAPolymerase（2.5U/μL）0.3μL混合后用移液槍抽打混勻，封蓋后短暫離心待用。8.2.3將離心管置于PCR儀中，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃~61℃退火30s，72℃延伸30s～60s（每對引物的退火溫度及延伸時間參見附錄A29個循環(huán)，72℃總延伸5min，4℃保存。用200mL玻璃燒杯稱取瓊脂糖0.5g，加入0.5×TBE緩沖液50mL。杯口用錫箔紙蓋好封嚴(yán)，置微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。待瓊脂糖溫度達(dá)到50℃左右時加入2.5μLGoldenview，混勻，迅速將膠倒至模具中，放上樣梳。約20min待膠完全凝固后，拔下上樣梳，置于盛有0.5×TBE緩沖液的電泳槽中。吸取5μLPCR反應(yīng)液，上樣130V，電泳0.5h～1.0h。電泳結(jié)束后，取下瓊脂糖凝膠，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶大小，照相。8.4PCR產(chǎn)物測序使用試劑盒純化25μLPCR產(chǎn)物，提交至生物技術(shù)公司測序。4DB2308/T182—20239結(jié)果分析鑒定稻瘟病菌中是否攜帶某些抗稻瘟病基因時，如不能獲得特定長度的PCR產(chǎn)物，則可判斷試樣中不含有相應(yīng)的無毒基因；如可擴(kuò)增出特定長度的PCR產(chǎn)物，則需結(jié)合電泳結(jié)果和測序結(jié)果共同分析。所有無毒基因的擴(kuò)增序列應(yīng)與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)序列相比對。（規(guī)范性附錄）用于擴(kuò)增無毒基因的引物無毒基因引物序列（5′-3′）延伸時間（s）退火溫度(℃)Primer1Avr1-Co39FCTCTGAACAACTAAGCAACA4055RCAACCTGGACTCTTATTGATCPrimer2Avr-PiaFTTATTGCTACCACCTTCCTC3055RGTAGTAACTGAGTTGGCGTTPrimer3Avr-PiiFCCTCGGCTTCTTGTATATTACT3055RTAAATCGTGCGCTTTCAGATPrimer4Avr-PikFCTGCACACATCAACAGTCTT3056RTCACAGTTAAGGCAACGTAGPrimer5Avr-Pita1*FG