DB6540-T 022-2023 馬紅球菌PCR檢測(cè)方法

ICS

65.020.30CCS

B

416540

DB

6540/T

馬紅球菌

PCR

檢測(cè)方法PCR

test

method

for

streptococcus

equi

發(fā)布

實(shí)施伊犁哈薩克自治州市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB

6540/T

022— 本文件按照GB/T

《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由昭蘇縣西域馬業(yè)有限責(zé)任公司提出。本文件由伊犁州畜牧獸醫(yī)局歸口并組織實(shí)施。控制與診斷中心、新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院、尼勒克縣胡吉爾臺(tái)鄉(xiāng)畜牧業(yè)發(fā)展中心。本文件主要起草人：馬玉輝、呂燕、李海、趙紅瓊、劉璐、余萬(wàn)里、余海、葉斯哈提·胡安、蘆文軍、蔡鵬、蔡濤、顧偉芳、雷艷、倪艷、江阿拜?居瑪?shù)吕蘸?。DB

6540/T

022—

PCR

1 范圍本文件規(guī)定了馬紅球菌的檢測(cè)方法。本文件適用于馬匹上呼吸道滲出物（鼻拭子）及糞便（肛拭子）樣本中馬紅球菌的檢測(cè)。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB

19489 實(shí)驗(yàn)室

生物安全通用要求NY/T

獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。馬紅球菌 rhodococcus

equi,

R.

屬放線菌目、諾卡菌科、紅球菌屬。該菌是一種革蘭陽(yáng)性兼性胞內(nèi)寄生球桿菌，耐酸，無(wú)孢子，大多無(wú)鞭毛。R.

equi可以在肺泡巨噬細(xì)胞中存活并復(fù)制，導(dǎo)致不同動(dòng)物物種和人發(fā)生肺部和肺外化膿肉芽腫感染。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

chain

reaction,

體外酶催化合成特異DNADNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的兩條引物分別與模板兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以4種dNTPs為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán)，使欲擴(kuò)增的基因片段以幾何倍數(shù)擴(kuò)增。4 縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。R.

：馬紅球菌

equi)ChoE：膽固醇氧化酶

VapA：毒力相關(guān)脂蛋白

DNA：脫氧核糖核酸

(Desoxyribonucleic

acid)PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

chain

dNTP：脫氧核苷酸三磷酸

(Deoxynucleotide

ddH2O：雙蒸水

(Double

distilled

bpVapA

569

ChoE

957

DB

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022—Taq：水生棲熱菌

aquaticu)5 生物安全措施GB

19489中的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。6 診斷方法主要設(shè)備、試劑及耗材冰箱、速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴鍋、混勻器、高壓滅菌器、電子天平、PCR儀、電泳儀、凝膠成像10

μL，

μL，

μL

μL，100

μL，

μL管、一次性使用采樣器（拭子）、50%（體積比）甘油、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、細(xì)菌基因組提取試劑盒、緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、溴化乙錠、DNA

ladder、PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑（詳見(jiàn)附錄A）。樣本采集、保存6.2.1 樣本采集器具采樣器具為一次性無(wú)菌產(chǎn)品，一套清潔采樣工具僅限一個(gè)樣本使用。存放樣本的容器應(yīng)清洗干凈，121

℃

20

min滅菌后使用，或?yàn)橐淮涡允褂脽o(wú)菌容器。6.2.2 樣本采集步驟8

cm～10

，肛門(mén)深度約為3

cm～5

cm），輕輕旋轉(zhuǎn)棉拭子不少于3圈，抽出棉拭子，將拭子樣品端置于含有1

mL甘油肉湯的無(wú)菌2

mL離心管中，室溫條件下

h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，2

℃～8

℃條件下3

d內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。如樣本不能及時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)置于-20

℃以下長(zhǎng)時(shí)間保存。6.2.3 核酸提取30NMNAT鑒別培養(yǎng)基上， ℃30培養(yǎng)48

h，觀察菌生長(zhǎng)情況。挑取生長(zhǎng)成灰黑色粘稠樣的單菌落，使用細(xì)菌基因組取細(xì)菌基因組，置于

℃待檢。檢測(cè)方法6.3.1 引物序列表1表1 引物列表DB

6540/T

022—6.3.2 PCR

擴(kuò)增體系6.3.2.1PCR

μL2×Taq

Master

，

μL；ddH2O，8.5

μL1

μL（0.5

μM）；下游引物，1

μL（

μM）；模板，2

μL。6.3.2.2 PCR

反應(yīng)程序：94

℃預(yù)變性

5

min；94

℃變性

s，55

℃退火

30

s，72

℃延伸

s，個(gè)循環(huán)；

℃延伸

10

，4

℃保存。

反應(yīng)循環(huán)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號(hào)的不同進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.6.3.2.3 ATCC

33701

致病性

equi

6939非致病性

equi

標(biāo)準(zhǔn)菌株）。6.3.3 PCR

產(chǎn)物電泳檢測(cè)用1×TAE電泳緩沖液配制的瓊脂糖（含100

μl/L熒光染料），在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛好沒(méi)過(guò)膠面，將5

μL

PCR產(chǎn)物加入樣品孔內(nèi)，電泳時(shí)以DL

Marker

作為參照，5

V/cm電泳約30

；凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果，拍照并記錄結(jié)果。結(jié)果判定致病性R.

PCR產(chǎn)物為957

bp及

bp兩條條帶。6.4.1 PCR

檢測(cè)試驗(yàn)成立判定DNA

marker957

bp和569

bp大小的兩條目標(biāo)擴(kuò)增條帶；陰性對(duì)照電泳道僅出現(xiàn)約

大小的一條目標(biāo)擴(kuò)增條帶，參見(jiàn)附錄B中圖，則試驗(yàn)成立。否則，試驗(yàn)不成立。6.4.2 PCR

檢測(cè)結(jié)果判定在6.4.1成立的基礎(chǔ)上，判定檢測(cè)結(jié)果：被檢樣品泳道擴(kuò)增到約

bp和569

大小的兩條目的條帶，則判定為致病性R.

核酸陽(yáng)性，見(jiàn)附錄B中圖B.2泳道1；被檢樣品泳道僅擴(kuò)增到約957

bp大小的R.

B中圖泳道2未出現(xiàn)，則判定為R.

equi核酸檢測(cè)陰性。6.4.3確證試驗(yàn)將提取的細(xì)菌基因組DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司及杭州有康生物科技有限公司委托完成基因組16S

rRNA的一代測(cè)序，將序列進(jìn)行拼接比對(duì)，比對(duì)結(jié)果為R.

，則表明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，該樣本中存在R.

equi。廢棄物處理和防止污染的措施檢驗(yàn)過(guò)程中的廢棄物，收集后統(tǒng)一高壓滅菌處理。DB

6540/T

022—

附 錄 A（規(guī)范性）PCR

診斷用主要試劑溶液配方A.1 TE

緩沖液（pH=8.0)Tris（1

mol/L

pH

） 10

mLEDTA（0.5

mol/L

pH

8.0） 2

mL加水定容至1

L，121

℃高壓滅菌15

，4

℃保存即可。A.2 TAE

電泳液（50×）Tris 242.0

g冰乙酸 57.1

mLEDTA（0.5

mol/L

pH

8.0） 100.0

mLddH2O補(bǔ)充至 1.0

L使用時(shí)用去離子水稀釋至1×的電泳液。A.3 0.01

mol/L

溶液（

7.2

～

pH

7.4）NaCl 8.0

gKCL 0.2

gKH2PO4

gNa2HPO4·12H20

g使用

mL去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2

~

，加水定容至1

L。

℃高壓滅菌15

min，室溫保存即可。A.4 1%瓊脂糖凝膠稱(chēng)取1.0

g瓊脂糖，加入

mL電泳緩沖液加熱溶解，加入溴化乙錠溶液至終濃度為1

μg/mL，15

℃～25 ℃冷卻至固態(tài)，現(xiàn)配現(xiàn)用。A.5 NMNAT

培養(yǎng)基稱(chēng)取培養(yǎng)基

g于1

L雙蒸水中，攪拌溶解，高壓滅菌20

，冷卻至50

~

60

℃。加入配制好的新生霉素，終濃度為25

μg/mL；放線菌酮，終濃度為40

μ；萘啶酸，終濃度為20

μ；亞碲酸鉀35

（100

mm4

℃貯存?zhèn)溆?。DB

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022—

附 錄 B（規(guī)范性）馬紅球菌菌落形態(tài)及

PCR

檢測(cè)電泳圖B.1馬紅球菌菌落形態(tài)圖NMNAT鑒別培養(yǎng)基30

℃培養(yǎng)48

h，馬紅球菌菌落形態(tài)見(jiàn)圖B.1。圖B.1

馬紅球菌菌落形態(tài)B.2 樣本采集、核酸提取步驟馬紅球菌檢測(cè)結(jié)果電泳例圖見(jiàn)圖。說(shuō)明：M—DL2000

Maker；1—致病性馬紅球菌（、VapA+）；2—非致病性馬紅球菌（、VapA-）。圖B.2

馬紅球菌

檢測(cè)電泳圖DB

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022—

附 錄 C（資料性）馬紅球菌基因擴(kuò)增片段C.1 馬紅球菌

基因擴(kuò)增片段（

bp）1

gtcaacaaca

ggtacaagtt

cgcccgcacc61

ggccgcaaga

tcgtgcccaa

cgtgtacgac121

ttcgagtaca

agtcgggcct

cggcggtgag181

gtcatctacg

agacctacct

cgcgcaggcc241

gcggccaccg

tcaccaaggt

cgcgccggcc301

accggcagcg

agcagggcaa

cgtcgtcgcc361

accaaggtcg

gcagcgtcgg

caccagcaag421

ctcctggtct

tgtcgtcgca

agtcggcgag481

ggctggggca

accacatgtg

ggacgccacc541

ggatccaagc

actgggccga

cccgacggca601

ccgatcttcg

agacctacgt

cagcctgtac661

ctggccatca

tcaattcggg

caccggcaag721

gtcgatctca

tcgacatggc

caagaaggtg781

ttcgacaaga

ccgatctgtt

cggcgtgtac841

aagacgtggg

gcgtgctgct

gaacaaggcg901

accgacaact

acgtggtgga

C.2 馬紅球菌

基因擴(kuò)增片段（

bp）1

atgaagactc

ccacagccgt

agctgcggct61

gcggctatga

ttgattccgg

tagcagcagt121

gcgattctca

ctgggagcta

tgacagctcg181

acgacttcgt

gagcaagcga

taccgccggg241

c