穩(wěn)定高效表達豬CD163的MARC-145細胞系的構(gòu)建與鑒定中期報告

穩(wěn)定高效表達豬CD163的MARC-145細胞系的構(gòu)建與鑒定中期報告一、摘要本文報道了利用真核表達載體pCDNA3.1將豬CD163基因轉(zhuǎn)染MARC-145細胞并篩選獲得穩(wěn)定細胞系的過程，以及對該細胞系的基本特性進行的初步鑒定。結(jié)果表明，通過G418抗生素的篩選，成功獲得了豬CD163穩(wěn)定表達的MARC-145細胞系，其CD163基因在轉(zhuǎn)染后表達量顯著升高。Westernblot分析進一步驗證了該細胞系中CD163蛋白的高表達，并發(fā)現(xiàn)該細胞系的細胞周期及增殖能力與野生型MARC-145細胞相似。二、背景CD163是一種單核細胞表面受體，分為兩個亞型：膜結(jié)合型和溶菌酶型。CD163主要表達在單核/巨噬細胞表面，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、清除體內(nèi)游離血紅蛋白等生理活動。由于其在生理和病理狀態(tài)下的重要生物學功能，CD163已成為研究熱點。目前已有多個研究利用轉(zhuǎn)染方式構(gòu)建CD163的穩(wěn)定表達細胞系，用于研究其分子機制及細胞生物學特性。MARC-145細胞屬于肺部成纖維細胞，被廣泛應(yīng)用于豬繁殖障礙與消耗性疾病病毒的研究。近年來，MARC-145細胞亦廣泛應(yīng)用于其它研究領(lǐng)域如基因工程疫苗的開發(fā)、基因敲除等。因此，將豬CD163基因轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞可為研究豬CD163功能提供新的模型。三、實驗設(shè)計1）構(gòu)建真核表達載體pCDNA3.1-CD163：將豬CD163基因獲取并克隆到真核表達載體pCDNA3.1上，該載體帶有Ecogpt和neomycin抗生素的選擇標記。2）轉(zhuǎn)染MARC-145細胞：采用Lipofectamine?2000試劑進行轉(zhuǎn)染，將pCDNA3.1-CD163載體轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中。3）篩選穩(wěn)定細胞系：轉(zhuǎn)染后48h，在MARC-145細胞培養(yǎng)基中加入200μg/mLG418抗生素進行篩選，單個克隆再次挑選后得到穩(wěn)定表達豬CD163的MARC-145細胞系。4）mRNA水平檢測：通過qPCR檢查MARC-145細胞中CD163mRNA的表達水平。5）蛋白水平檢測：采用Westernblot檢查MARC-145細胞中CD163蛋白的表達水平。6）細胞周期檢測：通過流式細胞術(shù)檢查MARC-145細胞中細胞周期的變化。7）細胞增殖能力檢測：通過MTT實驗檢查MARC-145細胞中細胞增殖的能力。四、結(jié)果分析1）成功構(gòu)建真核表達載體pCDNA3.1-CD163：經(jīng)酶切與測序驗證，pCDNA3.1-CD163載體構(gòu)建成功。2）穩(wěn)定表達豬CD163的MARC-145細胞系的篩選：經(jīng)G418篩選得到了一系列穩(wěn)定表達豬CD163的MARC-145細胞系，其中某一克?。∕ARC-CD163）的CD163mRNA表達量較高，進一步驗證該細胞系中CD163的表達水平。3）CD163在穩(wěn)定表達的MARC-145細胞中表達量顯著升高：qPCR分析結(jié)果表明，MARC-CD163細胞系中CD163的表達量較野生型MARC-145細胞（對照組）顯著升高（P<0.05）。4）穩(wěn)定表達豬CD163的MARC-145細胞系中CD163蛋白表達水平升高：Westernblot分析結(jié)果表明，MARC-CD163細胞系中CD163蛋白表達水平明顯升高，與野生型MARC-145細胞相比，克隆MARC-CD163中CD163的表達量約為其2.5倍。5）穩(wěn)定表達豬CD163的MARC-145細胞與野生型細胞周期和增殖能力相似：通過流式細胞術(shù)和MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，MARC-CD163細胞系的細胞周期及增殖能力與野生型MARC-145細胞相似。五、結(jié)論本實驗成功地構(gòu)建了真核表達載體pCDNA3.1-CD163，將豬CD163基因轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中并獲得了一系列穩(wěn)定表達豬CD163的細胞系，其中MARC-C