醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)各章節(jié)名詞解釋復(fù)習(xí)重點

緒論基因（gene）：是合成有功能的蛋白質(zhì)或RNA所必需的全部DNA，包括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列及為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列。斷裂基因（splitegene）真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因基因組（genome）：是指一個物種的單倍體的染色體所攜帶的全部遺傳信息。C值（Cvalue）：一種生物體單倍體基因組的DNA含量總是恒定的，它通常稱為該物種DNA的C值。C值矛盾：生物體的進(jìn)化程度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象（又稱：C值悖論，Cvalueparadox）必需基因：指關(guān)系到生物體存活的基因，可通過基因突變的方法確定致死位點的數(shù)量，以得知基因組必需基因的數(shù)量重疊基因（overlappinggene）是指兩個或兩個以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個或兩個以上基因的組成部分。類核（nucleoid）：是指原核生物基因組通常由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，在細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體的形式，在細(xì)胞內(nèi)形成一個致密的區(qū)域。轉(zhuǎn)座子：能在基因組中從一個位點移至另一位點的DNA序列稱為轉(zhuǎn)座因子（transposableelement），又稱為可轉(zhuǎn)座元件插入序列(insertionsequence，IS)：2000bp以內(nèi)，兩端正向重復(fù)序列（directrepeats，DR）、反向重復(fù)序列（invertedrepeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)：2000～20000bp之間，兩端由一對IS元件組成，帶有與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因和其他基因。質(zhì)粒（plasmid）：是指一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。質(zhì)粒的不相容性：兩種不同的質(zhì)粒因利用同一復(fù)制和維持機(jī)制，在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過程中會發(fā)生競爭，從而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失的現(xiàn)象。Alu家族是靈長類基因組特有的含量豐富的中度重復(fù)序列，是散在重復(fù)序列中最大的一個家族，因序列內(nèi)部有限制性內(nèi)切酶AluI的酶切位點而得名。反向重復(fù)序列：是指兩個相同順序的互補拷貝在同一DNA鏈上的反向排列。衛(wèi)星DNA是另一類高度重復(fù)序列，這類重復(fù)序列的重復(fù)單位一般由2-10bp組成，成串排列。多基因家族（multigenefamily）：是指由某一祖先基因經(jīng)過復(fù)制和變異所產(chǎn)生的一組基因。假基因(pseudogene)具有與功能基因相似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后生成無功能的蛋白質(zhì)的基因，常用ψ表示。母系遺傳。子代線粒體基因組來自母親，父系的線粒體基因組在精卵結(jié)合時一般不能進(jìn)入卵細(xì)胞。因此，在子代個體發(fā)育過程中沒有父母雙方線粒體DNA的重組發(fā)生?；蚪M學(xué)（Genomics）是一門對生命有機(jī)體全基因組進(jìn)行序列分析和功能研究的新興學(xué)科。人類基因組計劃（TheHumanGenomeProject，HGP）是二十世紀(jì)九十年代初開始啟動的多國科學(xué)合作計劃，對少數(shù)人進(jìn)行全基因組（即24條非同源染色體，共30億堿基）的測序和拼接，繪制出人類基因的譜圖。遺傳圖譜（geneticmap）：又稱連鎖圖譜(linkagemap)，它是以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離為圖距的基因組圖。遺傳多態(tài)性：在一個遺傳位點上具有一個以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%物理圖譜（physicalmap）：利用限制性內(nèi)切酶將大分子DNA切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離〔堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)〕為路標(biāo)的圖譜。物理圖譜的完成是一個里程碑式的成功，它準(zhǔn)確地得出了基因的相對位置?；驁D譜（轉(zhuǎn)錄圖譜）：在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜?；蚨ㄎ豢寺。菏侵咐梦⑿l(wèi)星和SNP全基因組掃描來搜索與疾病性狀緊密相關(guān)的位點，從而確定疾病相關(guān)基因的位置并進(jìn)一步獲得克隆。比較基因組學(xué)：是一門新興的交叉學(xué)科，在基因組學(xué)水平上研究不同物種在基因組結(jié)構(gòu)與功能方面親緣關(guān)系、內(nèi)在的聯(lián)系，以及進(jìn)化地位。宏基因組是指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組學(xué)就是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象,以功能基因篩選和測序分析為研究手段,通過非培方法進(jìn)行某個特殊生態(tài)環(huán)境中微生物群落的鑒定。主要技術(shù)包括DNA的提取、文庫的構(gòu)建和目標(biāo)基因克隆的篩選?？捎糜诎l(fā)現(xiàn)新基因、開發(fā)新的生物活性物質(zhì)、研究群落中微生物多樣性等。蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics):指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律。2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilizedpHgradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS組成的分離系統(tǒng)，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質(zhì)等電點（pI）的差異進(jìn)行分離，SDS則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離。等電聚焦（IEF）：在電場中電泳基質(zhì)形成一個從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運動到各自的pI處時，所帶凈電荷變?yōu)榱悖谑峭Ｖ惯w移而留在該位置上。這種不同的蛋白質(zhì)分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開的現(xiàn)象稱為等電點聚焦。SDS：在PAGE系統(tǒng)中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統(tǒng)。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級和四級結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負(fù)電荷大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)的分子量大小。質(zhì)譜分析法（MS）是指在一定條件下，將樣品分子電離成離子，然后通過測定這些離子的質(zhì)荷比（m/z）和強(qiáng)度來進(jìn)行定性和定量的一種分析方法。質(zhì)譜分析法的過程為：將樣品氣化并電離成帶電離子，然后通過一定方法將不同m/z的離子分開，并測定其強(qiáng)度，繪出質(zhì)譜圖，對質(zhì)譜圖進(jìn)行分析可得到關(guān)于樣品分子結(jié)構(gòu)和定量方面的信息。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖：有機(jī)分子受到電子轟擊后，會斷裂形成不同的多種離子，以離子的質(zhì)荷比m/z為橫座標(biāo)，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到的質(zhì)譜圖稱為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，也叫棒圖。電噴霧質(zhì)譜（ESI）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI）完整的現(xiàn)代質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)五部分組成，此外還有一個保持質(zhì)譜儀高真空度的真空系統(tǒng)。離子源和質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀最重要的兩個部件，也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。肽質(zhì)量指紋圖譜法基本過程為：蛋白質(zhì)混合物樣品經(jīng)過2-DE分離后，從膠上切下需要鑒定的蛋白質(zhì)斑點，用胰蛋白酶進(jìn)行水解，胰蛋白酶在特定位點切割蛋白質(zhì)，形成長短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF質(zhì)譜儀對多肽混合物進(jìn)行質(zhì)量分析，得到肽片段質(zhì)譜圖，一個質(zhì)譜峰代表一種肽片段離子。由于各種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)不同，胰酶水解后產(chǎn)生的肽片段數(shù)目及質(zhì)量均不相同，具有特征性，因此將得到的肽片段質(zhì)譜圖稱為PMF。肽序列標(biāo)簽鑒定法蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，在蛋白質(zhì)上隨意選取一個四肽序列，根據(jù)概率論計算，另一個蛋白質(zhì)上出現(xiàn)相同四肽序列的概率為1/204，即1/160,000，因此從理論上說，只要測定一個蛋白質(zhì)中5~6個氨基酸殘基的序列，就足以作為鑒別蛋白質(zhì)的特異性標(biāo)簽，稱為肽序列標(biāo)簽。酵母雙雜交技術(shù)(yeasttwo-hybridsystem)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展出來的一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段，它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個功能結(jié)構(gòu)域融合，通過質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞，以酵母細(xì)胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標(biāo)志。等電點：在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點。等電聚焦電泳:利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。等點聚焦：就是在電泳槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時，不同的蛋白質(zhì)即移動到或聚焦于與其等電點相當(dāng)?shù)膒H位置上；基因工程基因工程（geneengineering）：又稱DNA重組技術(shù)（DNArecombination），是指將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。分子克?。╩olecularcloning）：是指將目的DNA片段與載體重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得該DNA分子大量拷貝的技術(shù)。限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）：簡稱限制酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶?；匚慕Y(jié)構(gòu)（palindromestructure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限制酶所識別）。粘性末端（stickyend）：指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。同工異源酶（isoschizomers）：指來源不同，但能識別和切割同一位點的酶。同尾酶（isocaudarner）：指識別序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的酶。Klenow片段：補齊雙鏈DNA的3末端，同時可使3末端DNA標(biāo)記上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。DNA序列分析。TaqDNA聚合酶（簡稱Taq酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有5→3聚合酶活性和依賴于聚合作用的5→3逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）：分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。末端轉(zhuǎn)移酶的功能主要有：在載體或目的基因3末端加上互補的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。用于DNA3末端的同位素探針標(biāo)記。DNA連接酶（DNAligase）：稱為基因工程的縫紉針，它的主要功能是催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團(tuán)與3羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。DNA連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶兩種類型。堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基團(tuán)。主要用途有：除去DNA片段上的5磷酸以防自身連接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標(biāo)記前，從RNA或DNA上除去5端的磷酸。T4多核苷酸激酶核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：除去粘性末端以產(chǎn)生平末端。除去cDNA合成時形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況。載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。克隆載體：能將載體外源DNA在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的DNA的載體。pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆載體，長為4.36Kb。pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細(xì)菌。溶原性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，可將自身的DNA整合到細(xì)菌的染色體中，和細(xì)菌染色體一起復(fù)制。M13噬菌體粘粒(cosmid)是由質(zhì)粒和噬菌體的cos位點構(gòu)建而成。表達(dá)載體是指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。報告基因：是指處于待測基因下游并通過轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平來反映上游待測基因功能的基因，又稱報道基因。終止子：一個基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉(zhuǎn)錄的功能。增強(qiáng)子（enhancer）：是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件?；蚪M文庫（genomiclibrary，G-文庫）是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群。轉(zhuǎn)化（transformation）：是指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。藍(lán)白斑篩選法：某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸-肽的DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)-互補，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果重組克隆呈藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ基因中MCS，lac-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍(lán)白斑篩選法。變性（denaturation）：在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程。融解溫度（meltingtemperature，Tm）：在熱變性過程中，紫外吸收增加達(dá)到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度。復(fù)性（renaturation）：指變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為“退火”。核酸分子雜交（molecularhybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補的原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交。核酸探針（nucleicacidprobe)：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補雜交，雜交后可用特殊方法檢測的已知被標(biāo)記的核酸分子。原位雜交（Insituhybridization）是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對其檢測的方法。熒光原位雜交（fluorescencein-situhybridization,FISH）是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進(jìn)行檢測的技術(shù)?；蛐酒?genechip)：又稱DNA芯片（DNAchip）或DNA微陣列（DNAmicroarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纖維膜等載體。該技術(shù)是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)上的一種高效、快速的核酸序列分析手段。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)是生命科學(xué)界的重大發(fā)明，是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶可識別特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對目的DNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，簡稱PCR-SSCP）本法就是將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。巢式PCR（nestedPCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）one-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA

為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。多重PCR(multiplexPCR)PCR一般由一對引物擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片段，以此手段診斷疾病的效率低。為提高效率，常采用多重PCR技術(shù)。該技術(shù)是在一個反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段，由于每對引物擴(kuò)增的片段長度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對稱PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50～100:1。在PCR最初10-15個循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測定DNA序列的要求。反向PCR（inversePCR）擴(kuò)增長片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR實時熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法重組PCR（recombinantPCR）：將兩個不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。該技術(shù)主要應(yīng)用于DNA片段的任何位置引入點突變、插入、缺失以及兩個不相鄰片段的連接。其基本原理是將突變堿基、插入或缺失片段、或一種物質(zhì)的幾個基因片段的部分堿基設(shè)計在引物中，先分段對模板擴(kuò)增，除去多余的引物后，將產(chǎn)物混合，再用一對引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到的產(chǎn)物是一重組合的DNA。擴(kuò)增曲線熒光閾值：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值Ct值：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)SYBRGreen：只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光（SYBRGreen1結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位）變性時，DNA雙鏈分開，無熒光在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時做熔解曲線分析TaqMan：5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針MolecularBeacon：分子信標(biāo)生物分子的分離純化生物分子（Biomolecule）泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。生物大分子：勻漿(Homogenization)細(xì)胞被置于一密閉的容器中(常為玻璃).勻漿器配有一非常合適的插頭,通過其上下及左右的往復(fù)運動來破碎細(xì)胞.超聲(Sonication)超聲波發(fā)生器可直接浸入到細(xì)胞懸浮物中,超聲波發(fā)生器會經(jīng)振動發(fā)出高頻率的聲波而使細(xì)胞破碎.PMSF(苯甲基磺酰氟)β－巰基乙醇（β-mercaptoethanol）二硫蘇糖醇(DTT)還原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly）鹽溶--在低濃度時,由于鹽能屏蔽蛋白之間的電荷-電荷相互作用,添加鹽通常會增加荷電分子的溶解性。鹽析--大量鹽奪走水分子，破壞水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞親水膠體，蛋白質(zhì)分子形成沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法降低水溶液的介電常數(shù)，減少溶劑的極性，削弱溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。選擇性沉淀法生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白變性沉淀而得到分離提純。常用的有熱變性，選擇性酸堿變性，有機(jī)溶劑變性等電點沉淀法不同等電點的電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，主要用于去除雜蛋白有機(jī)聚合物沉淀法聚乙二醇PolyethyleneGlycol,PEG透析：將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品置于袋內(nèi)，將透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到部分純化。密度梯度離心法：雙鏈DNA,單鏈DNA,RNA和蛋白質(zhì)具有不同的密度，可用密度梯度離心形成不同密度的純樣品區(qū)帶，達(dá)到分離目的。酚抽提法(SDS法）本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過改良，以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。甲酰胺解聚法1987年Kupiec等報道了甲酰胺（formamide）解聚法，該法的細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（即染色質(zhì)），然后通過火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶K和有機(jī)溶劑。玻棒纏繞法用該法收集高分子量DNA的沉淀始于20世紀(jì)30年代，現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經(jīng)改進(jìn)而來。本法有兩個關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀在細(xì)胞裂解液和乙醇的交界面；二是將DNA沉淀纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNA從無水乙醇中轉(zhuǎn)移至pH8.0的TE緩沖液中。堿裂解法染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。SDS裂解法是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，去壁細(xì)菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶破壞細(xì)胞壁后，沸水浴裂解細(xì)胞的同時可破壞DNA鏈的堿基配對，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA變性，但CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈。當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒DNA。CsCl-EB法：利用CsCl形成的連續(xù)密度梯度，在過量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。聚乙二醇沉淀法（一種分級沉淀法）柱層析法（樹脂）酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法：分離總RNA磁性球珠分離法該法聯(lián)合利用了oligo（dT）與poly（A）的互補配對、生物素（biotin）與鏈親和素（streptavidin）的結(jié)合特異性以及磁性分離原理，可對poly（A）+RNA進(jìn)行高效、靈敏及快捷的分離。純度（purity）或比活性（specificactivity），以增加單位蛋白質(zhì)重量中靶蛋白的含量或生物學(xué)活性（比活常以活力單位數(shù)/毫克蛋白質(zhì)表示），即從蛋白混合物中設(shè)法去除不要的雜蛋白和變性的靶蛋白，使靶蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最高值。鹽析法：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。等電點沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。凝膠過濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。離子交換層析：根據(jù)各種離子或離子與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分類純化密度梯度（區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法電泳(elctrophoresis)：蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳。(elctrophoresis)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形成。按照等電點的大小，生物分子在pH梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚焦。親和層析（AffinityChromatography)是以蛋白質(zhì)與結(jié)合在介質(zhì)上的配基間的特異親和力為工作基礎(chǔ)。配基可以是生物學(xué)特異的，如底物、抗體、抑制劑、輔酶及蛋白質(zhì)（如抗原、抗體）、核酸。也可以是具有相對特異相互作用的凝集素（糖結(jié)合蛋白）、染料和疏水分子(亦可歸屬疏水相互作用色譜)。親和層析是應(yīng)用了特定蛋白的生物學(xué)特異性而不是物化特性。具有親和選擇性強(qiáng)，純化效率高，可以一步純化。GST融合載體毛細(xì)管電泳（CE）高效液相色譜（HPLC）分子生物學(xué)新技術(shù)及其應(yīng)用代謝組(metabolome)是指一個細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物的集合,包含一系列不同化學(xué)型的分子,比如肽、碳水化合物、脂類、核酸以及異源物質(zhì)的催化產(chǎn)物等。代謝組學(xué)：通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。高效液相色譜技術(shù)（HPLC）高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS)毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS)：毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道、采用高壓直流電場為驅(qū)動力的的新型液相分離技術(shù)，通過離子化合物的質(zhì)荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實現(xiàn)分離。只有CE，解釋不完整。核磁共振技術(shù)（NMR）：基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場的作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生的能級躍遷譜學(xué)，主要用于反映化合物結(jié)構(gòu)中的H和C原子的位置信息。miRNA：是由21~25個核苷酸組成的非編碼RNA；它通過與靶基因的3-UTR的配對，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)；它在生物體生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA基因克隆：miRNA克隆是依賴于其本身的特殊結(jié)構(gòu)，5′端的磷酸基團(tuán)和3′端的羥基基團(tuán)，以T4RNA連接酶在分子末端加上連接子，然后利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得目的片段，克隆到合適的載體，最后測序驗證。PAGE/Northernblotting：基本原理：PAGE/Northernblotting與常規(guī)核酸雜交技術(shù)原理相同，都是根據(jù)堿基互補配對原理，設(shè)計特異探針，與膜雜交，經(jīng)放射自顯影后分析雜交信號。唯一的差別在于選擇對小分子RNA分離效率更高的PAGE代替瓊脂糖作為分離膠。MicroRNA基因芯片技術(shù)：即經(jīng)過標(biāo)記的待測microRNA與芯片上特定位置的探針根據(jù)堿基互補配對原則雜交，再經(jīng)特定儀器掃描，以計算機(jī)相關(guān)軟件對熒光信號進(jìn)行檢測，并轉(zhuǎn)化為可讀的數(shù)字信息，最后經(jīng)大量數(shù)據(jù)分析篩選出有顯著表達(dá)差異的microRNA。MicroRNA實時定量PCR：利用能特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物的熒光物質(zhì)，顯示PCR產(chǎn)物的動態(tài)累積，得到S型的擴(kuò)增曲線；假設(shè)該曲線的前期PCR符合指數(shù)性擴(kuò)增，于是在單純指數(shù)方程的基礎(chǔ)上，通過比較產(chǎn)物積累的速度來間接比較初始模板的分子數(shù)。最初，實時定量PCR被用于定量檢測小RNA分子的前體表達(dá)；現(xiàn)在，經(jīng)過方法改進(jìn)可用于檢測成熟小RNA分子的表達(dá)?；蛟\斷血常規(guī)（MCV,MCH）基因診斷指利用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測體內(nèi)DNA或RNA在結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平上的變化，從而對疾病做出診斷的方法，通常又稱為分子診斷(MolecularDiagnosis)。lncRNABiomarkerisameasurableindicatoroftheseverityorpresenceofsomediseasestate.Moregenerallyabiomarkerisanythingthatcanbeusedasanindicatorofaparticulardiseasestateorsomeotherphysiologicalstateofanorganism.MolecularbiomarkershavebeendefinedasbiomarkersthatcanbediscoveredusingbasicandacceptableplatformssuchasgenomicsandproteomicsDNApolymorphisms-RFLPDNApolymorphisms-VNTRDNApolymorphisms-SNP核酸分子雜交：來源不同的DNA（或RNA）片段，按照堿基互補關(guān)系形成異源雙鏈分子的過程。Southern印跡雜交Northern印跡雜交點雜交（Dot-Blot）反向點雜交（ReverseDot-Blot）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）：在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性——退火——延伸三個基本反應(yīng)步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。DNA芯片技術(shù)熒光原位雜交比較基因組雜交多重探針連接擴(kuò)增Multiplexligation-dependentprobeamplification(MLPA)變性高效色譜分析Denaturinghighperformanceliquidchromatography(DHPLC)第一代：雙脫氧核苷酸末端終止法第二代：焦磷酸測序（Pyrosequencing）第三代：單分子實時測序（SingleMoleculeRealTimeSequencing,SMRT)杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchennemusculardystrophy）癥狀前診斷（Asymptomaticdiagnosis）產(chǎn)前診斷（Prenataldiagnosis）著床前診斷（Preimplantationdiagnosis）核酸雜交捕獲（HybridCaptureⅡ，HCⅡ）基因治療基因治療（Genetherapy）廣義概念將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。基因矯正（genecorrection）對于致病基因中的異常堿基進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常功能；基因置換（genereplacement）用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細(xì)胞DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)；基因增補（geneaugmentation）將正?；?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達(dá)，以補償缺陷基因的功能，但致病基因未去除；基因表達(dá)調(diào)節(jié)（modulation）指將特定的反義核酸、RNA干擾或核酶等技術(shù)抑制目的基因表達(dá)從而消除致病基因的作用。自殺基因這種基因?qū)胧荏w細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細(xì)胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞受體細(xì)胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對正常細(xì)胞則無傷害作用。免疫基因治療將某些細(xì)胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強(qiáng)患者的抵抗力。耐藥基因治療在腫瘤化療過程中，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。慢病毒(HIV)載體Lentivirus腺病毒載體腺病毒相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。痘苗病毒載體：線形雙鏈DNA的有包膜病毒，其核心顆粒不依賴宿主細(xì)胞而獨立引進(jìn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，宿主范圍廣泛且易于培養(yǎng)，容易獲得高滴度的病毒顆粒。同時痘苗病毒基因組中大量非必需基因的缺乏并不影響其在宿主細(xì)胞的復(fù)制能力，可允許在同一或不同非必需區(qū)插入多個基因，以表達(dá)多種或一種外源蛋白。脂質(zhì)體載體：是用人造雙層磷脂質(zhì)，包裝DNA后形成的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體載體無毒無抗原性，目的基因與脂質(zhì)體的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可單獨或聯(lián)合其他載體使用，并可通過靜脈注射使目的基因進(jìn)入特定部位。分子耦聯(lián)載體：由DNA、DNA結(jié)合因子和配體三部分組成。配體與特異的受體結(jié)合，經(jīng)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，將目的基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。多聚物載體：是利用帶正電荷的多聚陽離子與帶負(fù)電荷的DNA相結(jié)合，形成穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體相結(jié)合，而被攝入到細(xì)胞中。聚合物聚乙烯亞氨(PEI)：PEI分子量的增加，其對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性同時增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)：一種新型多聚物基因載體染色體載體一些參與哺乳動物基因表達(dá)和復(fù)制的染色體成分如轉(zhuǎn)座子、基因隔離子、增強(qiáng)子、基因座控制區(qū)、核骨架結(jié)合區(qū)以及基質(zhì)結(jié)合區(qū)等在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛?，均被用來設(shè)計載體，并整合入基因組而發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)座子是一類小的DNA片段，可以在染色體不同的區(qū)域移動并攜帶遺傳信息；轉(zhuǎn)座子的整合位點具有可預(yù)測性，從而提高轉(zhuǎn)基因治療的安全性。納米微生物技術(shù)基因治療載體Embryonicstemcells(ES)胚胎干細(xì)胞4~5d胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmassofblastocyst）具有自我更新和分化為任何類型組織細(xì)胞的能力（全能性）Pluripotentstemcells多能干細(xì)胞5~10Wfetus(Embryonicgermcells)外層細(xì)胞→胚胎等與發(fā)育相關(guān)組織內(nèi)細(xì)胞團(tuán)→人體所有器官Specialstemcells專能干細(xì)胞adult(adultstemcells,AS)hematopoieticstemcell(HSC)neuralstemcell(NSC)mesenchymalstemcell(MSC)造血干細(xì)胞Hematopoeiticstemcells（HSC）骨髓間質(zhì)干細(xì)胞Bonemarrowstromalcells（MSC）成纖維細(xì)胞是一種容易獲得和在體外培養(yǎng)并進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞。經(jīng)修飾的細(xì)胞又容易移植回體內(nèi)，必要時還可將已植入的細(xì)胞重新移走，使其介導(dǎo)的基因治療終止。外周血淋巴細(xì)胞（peripheralbloodlymphocyte，PBL）小干擾性RNA（siRNA）RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)個體化醫(yī)學(xué)個體化醫(yī)學(xué)拷貝數(shù)變異CNV或拷貝數(shù)多態(tài)性CNPGWASDHPLC技術(shù)大題緒論病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能特征病毒基因組基因組很小，且大小相差較大。病毒基因組可以由DNA組成，或由RNA組成。多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的RNA鏈組成；基因重疊。基因組的大部分可編碼蛋白質(zhì)，只有非常小的一部份不編碼蛋白質(zhì)。形成多順反子結(jié)構(gòu)（polycistronie）。病毒基因組都是單倍體（逆轉(zhuǎn)錄病毒除外）。噬菌體（細(xì)菌病毒）的基因是連續(xù)的，而少數(shù)真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的。原核生物基因組的一般特點基因組較?。?06bp～107bp）。操縱子結(jié)構(gòu)是原核生物基因組的功能單位。結(jié)構(gòu)基因均為單拷貝基因（除18s、28s、5srRNA及tRNA基因外）。不編碼的DNA序列約占全基因組的10%以內(nèi)（比真核生物少得多）：基因組中幾乎沒有重復(fù)序列，基因間幾乎沒有間隔，基因內(nèi)沒有內(nèi)含子（古細(xì)菌除外）。不編碼部分通常包含調(diào)控基因表達(dá)的序列DNA分子中有各種功能區(qū)，如復(fù)制起始區(qū)OriC，復(fù)制終止區(qū)TerC，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和終止區(qū)等，這些區(qū)域往往有反向重復(fù)序列，能形成特殊的結(jié)構(gòu)。真核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能特點1.基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)基因組是雙份的（即雙倍體，diploid），有兩份同源的基因組。2.基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。一個結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA分子，再翻譯生成一條多肽鏈。3.存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達(dá)百萬次以上。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼的區(qū)域。5.大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的（斷裂基因，splitgene）6.基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起始點，而每個復(fù)制子的長度較小蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)一、雙向凝膠電泳技術(shù)2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilizedpHgradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS組成的分離系統(tǒng)，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質(zhì)等電點（pI）的差異進(jìn)行分離，SDS則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離。1）等電聚焦電泳的基本原理等電聚焦（IEF）是60年代發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)分析分離手段，如圖所示，在電場中電泳基質(zhì)形成一個從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運動到各自的pI處時，所帶凈電荷變?yōu)榱?，于是停止遷移而留在該位置上。這種不同的蛋白質(zhì)分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開的現(xiàn)象稱為等電點聚焦。2）SDS的原理在PAGE系統(tǒng)中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統(tǒng)。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級和四級結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負(fù)電荷大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)的分子量大小。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)2-DE分離后，凝膠上的蛋白質(zhì)斑點須用一定的方法使其顯現(xiàn)出來，讓儀器或人眼檢測到。染色方法考馬斯亮藍(lán)染色銀染（不含戊二醛）熒光染色（Cy3,Cy5），放射性同位素標(biāo)記等二、液相色譜技術(shù)三、生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)譜分析法（MS）是指在一定條件下，將樣品分子電離成離子，然后通過測定這些離子的質(zhì)荷比（m/z）和強(qiáng)度來進(jìn)行定性和定量的一種分析方法。質(zhì)譜分析法的過程為：將樣品氣化并電離成帶電離子，然后通過一定方法將不同m/z的離子分開，并測定其強(qiáng)度，繪出質(zhì)譜圖，對質(zhì)譜圖進(jìn)行分析可得到關(guān)于樣品分子結(jié)構(gòu)和定量方面的信息。生物質(zhì)譜的組成見PPT42一個圖哦完整的現(xiàn)代質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)五部分組成，此外還有一個保持質(zhì)譜儀高真空度的真空系統(tǒng)。離子源和質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀最重要的兩個部件，也是不同質(zhì)譜儀的主要差別所在。電噴霧質(zhì)譜（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI）為離子源的質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物大分子研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的分析工具，因此被稱為生物質(zhì)譜（BMS）。四、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)1、基本概念酵母雙雜交技術(shù)(yeasttwo-hybridsystem)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展出來的一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段，它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個功能結(jié)構(gòu)域融合，通過質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞，以酵母細(xì)胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標(biāo)志。2、基本原理酵母雙雜交系統(tǒng)利用真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)構(gòu)特征。這些蛋白質(zhì)往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨的BD能與特定基因的啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄。而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)見書P39蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用疾病的蛋白質(zhì)組研究通過測定體液和組織的蛋白質(zhì)組,尋找特異疾病的生物標(biāo)記,即疾病特異性蛋白(diseasespecificproteins,DSPs)DSPs水平的變化對于疾病診斷、治療和判斷愈后具有重要意義,還可以成為研究藥物的藥理或毒理作用的靶點病原微生物的蛋白質(zhì)組研究確定致病菌毒力;尋找新的診斷標(biāo)記物;為疫苗的研制尋找新的候選抗原;闡明藥物抗菌作用機(jī)制與病菌耐藥性發(fā)生機(jī)理,為新的抗生素的研制尋找靶點蛋白質(zhì)組在藥物開發(fā)中的應(yīng)用疾病特異性蛋白的不斷發(fā)現(xiàn)為藥物設(shè)計提供了豐富的靶點以DSPs為靶點,分析其分子結(jié)構(gòu),定向合成有效藥物成為藥物設(shè)計的理想模式基因工程基因工程中常用的酶及其作用限制性核酸內(nèi)切酶：簡稱限制酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。限制酶能識別雙鏈DNA特異的48個堿基對，并在此序列內(nèi)特異切割DNA。限制酶功能：根據(jù)需要在特定的位點上精確切割雙鏈DNA分子?；匚慕Y(jié)構(gòu)（palindromestructure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限制酶所識別）DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為103kD，它具有3種酶活性：①5→3DNA聚合酶活性②3→5核酸外切酶活性③5→3核酸外切酶活性TaqDNA聚合酶（簡稱Taq酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有5→3聚合酶活性和依賴于聚合作用的5→3TaqDNA聚合酶可用于DNA測序及通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RDDP）②核糖核酸酶H活性（RNaseH）DNA聚合酶活性（DDDP）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）：分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。末端轉(zhuǎn)移酶的功能主要有：在載體或目的基因3末端加上互補的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。用于DNA3末端的同位素探針標(biāo)記。DNA連接酶DNA連接酶（DNAligase）：稱為基因工程的縫紉針，它的主要功能是催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團(tuán)與3羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。DNA連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶兩種類型。堿性磷酸酶堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基團(tuán)。主要用途有：除去DNA片段上的5磷酸以防自身連接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標(biāo)記前，從RNA或DNA上除去5端的磷酸。T4多核苷酸激酶核酸酶S1核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：除去粘性末端以產(chǎn)生平末端。除去cDNA合成時形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況。常見載體分類及其作用載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA?？寺≥d體：能將載體外源DNA在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的DNA的載體。能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)。分子量一般<10Kb。帶有遺傳篩選標(biāo)記。有適當(dāng)?shù)南拗泼该盖形稽c，便于外源DNA的插入和篩選。多克隆位點（multiplecloningsites，MCS）：載體上具有的多個限制酶的單一酶切位點。1）質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆載體，長為4.36Kb。它含有一個能保證高拷貝自我復(fù)制的復(fù)制起始點（Ori），并裝有四環(huán)素抗性（Tetr）基因和氨芐青霉素抗性（Ampr）基因供菌落篩選。在這兩個抗性基因中分別含有BamHI和PstI等限制酶的單一酶切位點，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，會導(dǎo)致這些標(biāo)志性基因的失活。pUC系列載體pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。pUC18和pUC19質(zhì)粒長約2.69Kb，除多克隆位點互為相反方向排列外，其它序列均相同。pUC質(zhì)粒含Ampr，可供菌落篩選。載體中裝入一個來自大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因序列中含有多克隆位點。2）噬菌體克隆載體野生型的噬菌體是線性雙鏈DNA，全長約48.5Kb，其中60%（約30Kb）是溶菌生長所必需，中間40%的區(qū)域為非必需，可被外源DNA片段代替而不影響噬菌體的生存。噬菌體5末端含12核苷酸的互補單鏈順序，是天然的粘性末端，稱為cos位點，噬菌體感染宿主菌后，其粘端通過堿基配對而結(jié)合，形成環(huán)狀DNA分子。M13噬菌體3）粘?？寺≥d體表達(dá)載體是指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。1）原核細(xì)胞表達(dá)載體 2）真核細(xì)胞表達(dá)載體真核表達(dá)載體的真核表達(dá)元件有：啟動子/增強(qiáng)子—終止位點和加polyA信號。原核質(zhì)粒序列：包括復(fù)制起始序列和抗藥基因標(biāo)記。啟動子：轉(zhuǎn)錄起始位點上游25~30bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100~200bp處為上游啟動子元件。增強(qiáng)子（enhancer）：是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。終止子和加polyA信號（AAUAA）?；蚬こ痰幕静襟E目的基因的獲取1）從基因文庫中獲取2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3）人工合成DNA片段4）直接從染色體DNA中分離目的基因載體的選擇目的基因和載體的連接載體鏈接方式見網(wǎng)上作業(yè)哦重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體的篩選和鑒定重組體的篩選和鑒定1）重組體的篩選根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)志篩選大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性基因（如Ampr、Tetr等），當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇某些質(zhì)粒載體如pBR322質(zhì)粒中有Ampr和Tetr抗性基因，在這兩個基因中裝有幾個常用的MCS，如將外源DNA片段插入BamHⅠ識別序列時，則此質(zhì)粒由Tetr變?yōu)閷λ沫h(huán)素敏感（Tets）。這種重組子導(dǎo)入宿主菌后，宿主菌在含四環(huán)素瓊脂糖平皿上不能生長而在含氨芐青霉素的平皿上能夠生長。在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長的細(xì)菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素篩選法。-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍(lán)白斑篩選法）某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸-肽的DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)-互補，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal形成藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果重組克隆呈藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ基因中MCS，lac-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍(lán)白斑篩選法。根據(jù)插入的外源性基因的性狀進(jìn)行篩選當(dāng)細(xì)胞生物合成途徑中某個酶的編碼基因失活后，該細(xì)胞成為營養(yǎng)缺陷型，如導(dǎo)入細(xì)胞的重組DNA能彌補缺陷的基因，那么培養(yǎng)基中就不需補充有關(guān)的營養(yǎng)成分，由此可挑選出含重組DNA的陽性細(xì)菌。核酸雜交技術(shù)篩選將轉(zhuǎn)化細(xì)菌平板轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，應(yīng)用特異性的核酸探針對其進(jìn)行原位雜交，可篩選出陽性克隆。對于噬菌體載體的克隆，此法也可通過噬菌斑的原位雜交篩選陽性克隆。通過斑點雜交和Southernblot雜交技術(shù)篩選。重組體的鑒定根據(jù)重組子大小鑒定酶切鑒定PCR鑒定DNA序列分析鑒定核酸復(fù)性的影響因素溫度和時間DNA濃度DNA分子大小和復(fù)雜度離子強(qiáng)度核酸探針的類型基因組DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針探針設(shè)計原則探針長度：一般要求在10～50bp。G／C含量為40％～60％。探針分子中應(yīng)避免互補序列。避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個，如GGGG-或-CCCC-。借助計算機(jī)相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較。理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點：檢測物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡便。標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值。標(biāo)記物對環(huán)境污染小，對人體無損傷，價格低廉。標(biāo)記物對檢測方法無干擾。分子雜交技術(shù)一般流程探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素）待測核酸樣品制備（分離，純化）雜交（液相，固相，原位雜交）雜交后處理（去掉非特異雜交分子）顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）結(jié)果分析Southern印跡雜交（Southernblot）步驟：DNA變性中和Southern印跡預(yù)雜交雜交洗膜檢測Northern印跡雜交步驟PPT上是圖微板酶聯(lián)雜交步驟PPT上是圖原位雜交基本流程細(xì)胞或組織切片的處理玻片清洗組織和細(xì)胞的固定增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性預(yù)雜交雜交雜交后漂洗結(jié)果檢測雜交條件優(yōu)化1、探針的選擇檢測單個堿基改變選用寡核苷酸探針。檢測單鏈靶序列選用與其互補的DNA單鏈探針或RNA探針。長的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體。100bp左右的探針適合原位雜交。2、探針的標(biāo)記方法在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)和價廉的HRP顯示系統(tǒng)等。3、探針的濃度隨探針濃度增加，雜交率也增加，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml。原位雜交中，一般各種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。4、雜交最適溫度若反應(yīng)溫度低于Tm10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。一般情況下，在不含變性劑甲酰胺時，大多數(shù)雜交反應(yīng)在65℃進(jìn)行，當(dāng)含50%甲酰胺時，在425、反應(yīng)時間和洗膜溫度雜交時間短了，反應(yīng)無法完成；長了引起非特異結(jié)合增多。一般雜交20h左右。雜交后的最終洗膜溫度一般應(yīng)低于Tm值5~12℃進(jìn)行基因芯片原理百度好了基因芯片的應(yīng)用基因表達(dá)水平的檢測基因突變和多態(tài)性的檢測基因芯片在藥物篩選中的應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用基因芯片在疾病診斷中的應(yīng)用感染性疾病診斷遺傳性疾病的診斷聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用PCR基本原理PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留復(fù)制，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在體內(nèi)，DNA復(fù)制是周期性的，所以基因擴(kuò)增的數(shù)量有限；PCR技術(shù)在體外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合適的底物和因子，通過對溫度的控制，使DNA不斷位于變性、復(fù)性和合成的循環(huán)中，達(dá)到擴(kuò)增DNA的目的。引物設(shè)計基本原則引物的長度典型的引物為18-24個核苷酸，在一定范圍內(nèi)引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性；引物長度的上限主要與反應(yīng)效率有關(guān)，所以一般又不能太長，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于72℃PCR產(chǎn)物長度一般來說，PCR產(chǎn)物長度對擴(kuò)增效率有影響。擴(kuò)增片段長度在普通PCR以200～500bp為宜；實時熒光PCR則為50～150bp。引物的均衡性和GC含量引物中堿基組成應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高(非特異性擴(kuò)增)或過低（特異性降低）都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物溶解溫度（Tm值）引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度.Tm=2(A+T)+4(C+G)引物自身引物間3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗;引物3’端的幾個堿基與模板DNA需嚴(yán)格配對，并最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)。5’端序列對PCR影響不如3’端大，常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物。PCR反應(yīng)條件（1）模板一般100ngDNA模板/100（2）引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus，水生棲熱菌)0.5-5U/100l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。對于大多數(shù)的PCR引物來說，Mg2+濃度為1.5mmol/L是適宜的，如果擴(kuò)增效果不好，則調(diào)整鎂離子的濃度可能會有所幫助。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。PCR(1)假陽性①PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。②陽性對照的污染。③標(biāo)本之間的交叉污染。④在采集標(biāo)本時，其他污染源帶來的污染。⑤使用帶有污染的試劑。PCR(2)假陰性假陰性是PCR反應(yīng)中另一個易出現(xiàn)的問題。造成的原因也比較多?？梢詺w納以下幾方面原因。1)標(biāo)本處理的原因。①處理標(biāo)本時，靶DNA丟失。②處理標(biāo)本時，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。③標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。2)PCR試劑問題。①引物設(shè)計不合理。②TaqDNA聚合酶失活。③Mg2+濃度過低或是沒有加。3)PCR擴(kuò)增過程中的問題①PCR擴(kuò)增儀故障。②PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問題①電泳時沒有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。③凝膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。PCR(3)引物二聚體形成引物二聚體的原因有：⑴兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3′端有互補區(qū)。⑵引物比例太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。PCR(4)非特異性PCR產(chǎn)物造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預(yù)防措施：①引物特異性不高或用量太大，應(yīng)更換引物或降低用量；②TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量太大，應(yīng)更換酶或降低酶使用量；③Mg2+濃度過高，可適當(dāng)調(diào)整其濃度；④退火溫度過低，可提高退火溫度；⑤延伸時間過長，可減少延伸時間；⑥熱循環(huán)次數(shù)過多，應(yīng)適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。實時熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法實時熒光定量PCR原理定量原理擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行RealtimePCR，就會按照起始DNA濃度由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。再由Ct值與起始模版的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，就可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品與標(biāo)品一樣，也可得到Ct值，并將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模版量。SYBRGreenISYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光（SYBRGreen1結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位）變性時，DNA雙鏈分開，無熒光在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時做熔解曲線分析TaqMan技術(shù)5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針生物分子的分離純化影響生物大分子提取效果的因素（1）pH值（2）鹽濃度（即離子強(qiáng)度）（3）溫度（4）水解酶（5）攪拌與氧化（6）有機(jī)溶劑根據(jù)作用原理生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型：（1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級沉淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。原因DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子對策重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）問題二：DNA降解。原因材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融對策盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問題三：DNA提取量少。原因?qū)嶒灢牧喜患鸦蛄可倨票诨蛄呀獠怀浞殖恋聿煌耆礈鞎rDNA丟失對策盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒分離純化的總體原則一是保證靶蛋白結(jié)構(gòu)的完整，防止降解和活性蛋白質(zhì)的變性；二是盡量滿足研究與診斷對靶蛋白純度的要求。純化蛋白質(zhì)總是希望純度和產(chǎn)率均高，例如純化某種酶，理想的結(jié)果是比活力和總回收率均高，但實際工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力盡可能高，而犧牲一些回收率，在工業(yè)生產(chǎn)和分子診斷中則正相反。蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化是依據(jù)其溶解性、分子質(zhì)量大小及形狀、電離性質(zhì)和生物學(xué)功能的差異而進(jìn)行的。分離純化的方法可分類如下：①以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、分配層析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀和結(jié)晶等；②以分子大小及形狀差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析等；③以電離性質(zhì)差異為依據(jù)的方法：電泳、離子交換層析等；④以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析。分子生物學(xué)新技術(shù)及應(yīng)用代謝組學(xué)：通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。特點1.關(guān)注于內(nèi)源性小分子化合物。2.對生物體系中的小分子化合物進(jìn)行定性定量研究3.內(nèi)源性小分子化合物的上調(diào)和下調(diào)指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子的影響。4.內(nèi)源性化合物的特點用來表征疾病和藥物篩選。應(yīng)用：藥物研發(fā)疾病研究植物代謝組學(xué)微生物代謝組學(xué)中藥現(xiàn)代化代謝組學(xué)研究一般包括四個步驟：第一步，給予生物體一定的刺激。這種刺激可以是基因的變異、剔除或引入，體內(nèi)生物過程的催化或抑制，致病或致病物質(zhì)(無機(jī)、有機(jī)、病毒、細(xì)菌、寄生蟲等等)的引入，以及各種環(huán)境因素的改變等等。第二步，代謝組數(shù)據(jù)的采集。用核磁共振、質(zhì)譜、色譜等分析手段測定其中代謝物的種類、含量和狀態(tài)以及其變化。第三步，建立表征代謝特征的時空模型。在代謝組學(xué)中最常用的建模方法是主成分分析(PrincipleComponentsAnalysis,PCA)。其基本思路是以一種最優(yōu)化方法濃縮數(shù)據(jù)，尋找?guī)讉€由原始變量線性組合而成的主成分,以揭示原始數(shù)據(jù)的特征，提取基本信息，實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的可視化和樣本的分類聚集。第四步，建立代謝物時空變化與生物體特性的關(guān)系，達(dá)到從不同層次和水平上闡述生物體對相應(yīng)刺激的響應(yīng)的目的。miRNA是由21~25個核苷酸組成的非編碼RNA；它通過與靶基因的3-UTR的配對，mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)；它在生物體生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。促進(jìn)mRNA的降解或抑制MicroRNA的起源與生物合成過程1.miRNA基因被轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA(RNA聚合酶Ⅱ)；2.pri-miRNA被剪切