獸藥殘留檢測技術(shù)磺胺類

第六章獸藥殘留檢測技術(shù)第五節(jié)磺胺類藥物殘留的危害分析與檢測方法1精選ppt一、概述磺胺類(Sμlfonamides)藥物是獸醫(yī)上較常用的一類合成抗感染藥物,具有抗病原體范圍廣、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便、易于生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)?；前匪幏N類繁多,獸醫(yī)上常用的有10余種(圖)

?；前匪巻为?dú)使用,病原體易產(chǎn)生耐藥性,與抗菌增效劑如TMP(甲氧芐啶)等聯(lián)用,抗菌范圍擴(kuò)大,療效明顯增強(qiáng),用來治療畜禽腸道感染、乳腺炎、肺炎等疾病。同時(shí)也被廣泛的用作飼料添加劑,用來增肥犢牛和豬。2精選ppt危害這種藥物可以殘留在動(dòng)物的體內(nèi),人食用后對人體產(chǎn)生耐藥性等副作用,尤其是致癌性物質(zhì)磺胺二甲嘧啶,能引起人的再生障礙性貧血,粒細(xì)胞缺乏癥等疾病。再生障礙性貧血:骨髓造血干細(xì)胞和/或造血微環(huán)境損傷性血液病。粒細(xì)胞缺乏癥又叫白細(xì)胞減少癥,本病多起病緩慢，慢性經(jīng)過，少數(shù)可無病癥。患者可有頭暈、乏力、頭痛、四肢無力、食欲不振、低熱、失眠等；可有易感染傾向，如易患癤癰、肺炎、尿路感染，甚至發(fā)生敗血癥等。3精選ppt根據(jù)腸道吸收的程度和臨床用途,分為內(nèi)服難吸收用于腸道感染的磺胺藥、外用磺胺藥、內(nèi)服易吸收用于全身感染的磺胺藥三大類。除磺胺脒(琥磺胺噻唑、酞磺胺噻唑現(xiàn)已少用)用于腸道感染、磺胺嘧啶銀局部外用外,其他均用于全身性細(xì)菌感染,某些品種亦用于弓形體病、球蟲病和住白細(xì)胞原蟲病的治療。不同的磺胺藥抗菌作用強(qiáng)度不同,一般依次為磺胺-6-甲氧嘧啶(SMM)>磺胺甲基異惡唑(SMZ)>磺胺異惡唑(SIZ)>磺胺嘧啶(SD)>磺胺二甲氧嘧啶(SDM)>磺胺對甲氧嘧啶(SMD)>磺胺二甲嘧啶(SM2′)>磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM′)。4精選ppt吸收后存在形式磺胺藥吸收后,一局部在血漿中保持游離狀態(tài)(游離型),一局部與血漿蛋白相結(jié)合(結(jié)合型),另一局部在肝臟中高度乙?；兂梢阴；前?。游離型具抗菌作用,且能透過毛細(xì)血管進(jìn)入各種體液和組織。結(jié)合型無抗菌活性,也不能透入體液或組織中,但結(jié)合較疏松,能不斷分解出游離型磺胺。乙?；腔前返闹饕x產(chǎn)物,無抗菌活性。5精選ppt體內(nèi)分布、代謝磺胺藥在體內(nèi)分布相當(dāng)廣泛。各種組織和體液均能到達(dá)。以血液中含量最高,肝、腎次之,胸水、腹水、滑膜液、房水中濃度也較高,并能透過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)?；前匪幵谏窠?jīng)、肌肉及脂肪組織中的含量那么較低?；前匪幹饕诟闻K代謝,代謝方式有乙?；⒘u基化、結(jié)合等,其中以乙酰化為主?；前匪幰阴；笫タ咕饔?且在尿中的溶解度降低,易在腎小管析出結(jié)晶,造成對泌尿道的損害。應(yīng)注意同服碳酸氫鈉,并增加飲水,可減少或防止其對泌尿道的損害。局部磺胺藥及代謝產(chǎn)物在肝內(nèi)成為水溶性的葡萄糖醛酸結(jié)合物而失去活性。6精選ppt排泄內(nèi)服難吸收的磺胺藥,主要由糞便排出;內(nèi)服易吸收的磺胺藥主要通過腎臟排泄,通過腎小球?yàn)V過或腎小管分泌到達(dá)腎小管腔內(nèi)的藥物,有一局部被腎小管重吸收。重吸收少、排泄快的藥物如磺胺異惡唑在尿中濃度較高,適用于治療泌尿道感染。主要由腎小管分泌,重吸收多的藥物在尿中濃度低,但在血中有效濃度維持時(shí)間較長,多屬長效如SMZ、SMM等?；前匪幧锌山?jīng)腸液、膽汁分泌排出,也可由乳汁排泄,但量較少。7精選ppt常見磺胺藥磺胺嘧啶三甲氧芐啶磺胺二甲嘧啶磺胺二甲氧嘧啶磺胺喹惡啉磺胺噻唑巴喹普林8精選ppt磺胺嘧啶屬廣譜抑菌劑,用于各種動(dòng)物敏感菌的全身感染。內(nèi)服易吸收,排泄較緩慢,血藥濃度易到達(dá)有效水平。磺胺嘧啶與血漿蛋白的結(jié)合率低,腦脊液中的濃度比其他磺胺藥高,因此是磺胺類藥中治療腦部細(xì)菌性感染的首選藥。鰻魚內(nèi)服放射性標(biāo)記磺胺嘧啶后,以膽和皮中含量最高,血液、肝和腎次之。9精選ppt磺胺嘧啶/甲氧芐啶豬內(nèi)服磺胺嘧啶/甲氧芐啶后,胃腸道吸收甲氧芐啶較磺胺嘧啶快,但甲氧芐啶消除期較磺胺嘧啶消除期緩慢。休藥1天甲氧芐啶殘留最高的靶組織為肝臟(0.29μg/kg),但磺胺嘧啶殘留最高的靶組織為腎臟(0.23mg/kg)。休藥8天所有組織均檢測不出磺胺嘧啶和甲氧芐啶的殘留量。在8℃的水溫,海水鱒魚投喂混合魚料(添加磺胺嘧啶和甲氧芐啶)后,開始時(shí)藥物消除很快,但到達(dá)某一殘留量時(shí)根本不再下降,即使休藥90天魚體內(nèi)的殘留量仍可被檢出。因此,在10℃以上的水溫,鱒魚用藥(磺胺嘧啶/甲氧芐啶)后的休藥期應(yīng)為60天,在10℃以下的水溫不得使用。10精選ppt三甲氧芐啶屬化學(xué)合成抗菌藥,曾稱“磺胺增效劑〞?？咕V與磺胺相近,它能抑制二氫葉酸復(fù)原酶,而磺胺藥那么抑制二氫葉酸合成酶。兩者合用,可使細(xì)菌的葉酸代謝受到雙重阻斷,因而可大幅度提高抗菌活性(可增效數(shù)倍至數(shù)十倍),并可減少抗菌菌株的出現(xiàn)。內(nèi)服吸收快而完全,體內(nèi)分布廣,組織中濃度一般比血中濃度高,肺、腎中濃度分別比血中濃度高17倍和10倍,膽汁中濃度分別比血中濃度高2.5倍和2倍。11精選ppt三甲氧芐啶三甲氧芐啶以非離子形式從腎排出,24h排出內(nèi)服量的40%~60%。少量從膽汁排泄,其濃度比血濃度高。馬、水牛、黃牛、奶山羊和豬靜脈注射的消除半衰期分別為4.2h、3.4h、o.94h、1.43h和2.5h。雞、鴨約2h。體內(nèi)代謝較少,代謝過程包括氮氧化和羥基化,所有代謝物之和不超過總殘留的5%。豬按規(guī)定劑量肌注后3~10天,組織中未檢出殘留量。連續(xù)飼喂10日劑量5mg/(kg·d),休藥3天只有一個(gè)肌肉樣品能檢測到殘留量34μg//kg(方法檢測限15μ釅kg),休藥5天有兩個(gè)皮/脂肪樣品的殘留量為31μg/kg,休藥10天為27μg/kg。12精選ppt三甲氧芐啶魚體內(nèi)吸收和消除取決于水溫。鱒魚喂服20mg/kg,15℃水溫、用藥后6h內(nèi)血漿中可以檢測到殘留量,但7℃水溫、血漿中檢測不到殘留量,即使延長到12h也是如此。魚體內(nèi)腎中殘留量最高,皮和血液次之。血藥濃度是肌肉濃度的2~3倍。消除半衰期約24h。主要通過膽汁排泄。三文魚飼喂30mg/(kg·d),連喂10日,休藥7~10天血漿中殘留量約12mg/kg,肌肉在喂服后立刻采樣測定,測得平均殘留量10740μg/kg,停藥30天和40天肌肉中平均殘留量為100μg/kg和10μg/kg。13精選ppt磺胺二甲嘧啶近年來細(xì)菌對本品的耐藥性增高,尤其是鏈球菌屬、奈瑟菌屬以及腸桿菌科細(xì)菌。主要用于巴氏桿菌病、乳腺炎、子宮炎、呼吸道及消化道感染,亦用以防治兔、禽球蟲病和豬弓形蟲病。內(nèi)服后吸收迅速而完全,維持有效血藥濃度時(shí)間較長?；前范奏奏ぴ谂ｓw內(nèi)的代謝方式有乙?；?、羥基化、結(jié)合等,其中以羥基化為主,其次為乙酰化,代謝物為6-羥甲基磺胺二甲嘧啶和N-乙?；前范奏奏ぁＱ汉湍讨兴幬餄舛茸罡?肌肉、腎和肝次之。肌肉、腎和肝中的N-乙?；前范奏奏舛缺饶杆帩舛鹊?但腎中的6-羥甲基磺胺二甲嘧啶濃度超過母藥濃度。14精選ppt磺胺二甲嘧啶奶牛內(nèi)服或肌注后,奶中母藥殘留量內(nèi)服較肌注高,但殘留消除期根本相同。例如,休藥3天奶中的乳糖結(jié)合物和乙酰化代謝物均低于10μg/kg,休藥4天奶中母藥殘留量均低于10μg/kg。豬體內(nèi)代謝主要以乙?；癁橹?血漿和組織中N-乙?；前范奏奏ごx物濃度最高,其他代謝物(如磺胺二甲嘧啶-寡糖綴和物、脫氨基磺胺二甲嘧啶等)那么次之。組織消除半衰期10~14h,血漿消除半衰期3~9天。休藥18天血漿中殘留量接近允許限量值(0.1mg/kg)。羊一次靜注107mg/kg后,體內(nèi)殘留消除很快,休藥5天組織(肉、肝、腎、脂肪)中殘留量低于0.1mg/kg。魚體內(nèi)的代謝物主要為N-乙?；前范奏奏?少量為羥基化衍生物和?；苌铩?5精選ppt磺胺二甲氧嘧啶主要用于防治犢牛、雞、兔球蟲病,亦用于防治雞傳染性鼻炎、禽霍亂、卡氏住白細(xì)胞原蟲病、豬狗的弓形體病及諾卡菌病。家禽飼服后吸收快而排泄慢,作用維持時(shí)間長。肝和腎中有較高的藥物濃度,血漿蛋白結(jié)合率為80%~85%。除腎臟外,其他組織中藥物濃度降低至0.1mg/kg或以下需休藥8天。蛋雞或火雞內(nèi)服后,蛋雞休藥6天、火雞休藥8天,這樣組織殘留可低于允許限量值(0.1mg/kg)。體內(nèi)乙?；实?代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶主要存在于血漿、組織和糞中,消除期約7天。16精選ppt磺胺二甲氧嘧啶蛋雞飲服1.0g/L/日或0.5g/L/日,連續(xù)5日,蛋中有較高的殘留,蛋清和蛋黃的最高殘留可達(dá)30mg/kg和9mg/kg;殘留降至0.1mg/kg,蛋清需體藥4~6天,蛋黃需休藥7天。與奧美普林(ormethoprim)聯(lián)用,三文魚用藥后3~8天,兩種藥物在血漿和組織中到達(dá)一個(gè)相對穩(wěn)定的殘留量?；前范籽踵奏さ淖罡咂骄鶜埩袅?血漿14.3mg/kg、肌肉17.7mg/kg、肝7.4mg/kg、腎6.8mg/kg;消除半衰期:血漿⒛h、肌肉19h、肝62h、腎45h。奧美普林的最高平均殘留量:血漿1.5mg/kg、肌肉3.7mg/kg、肝9.1mg/kg、腎166.0mg/kg;消除半衰期:血漿63h、肌肉143h、肝95h、腎410h。17精選ppt磺胺喹惡啉別名磺胺喹沙啉,為類白色或淡黃色粉末,無臭,不溶于水,溶于甲醇、乙醇,易溶于堿性溶液。磺胺喹惡啉屬磺胺類藥兼有抗球蟲作用,廣泛用于養(yǎng)禽業(yè),治療雞鴨的家禽霍亂及球蟲病。家禽內(nèi)服后吸收迅速,但排泄緩慢,殘留在組織器官及雞蛋中時(shí)間長。兔飼喂100mg/kg,一日兩次、連喂5日,肝和腎中殘留量較高,第4天達(dá)峰值。休藥7~8天,肝、腎和血漿中的殘留量降到0.1mg/kg。18精選ppt磺胺噻唑抗菌作用比磺胺嘧啶強(qiáng),能抑制細(xì)菌的二氫葉酸合成酶,阻礙細(xì)菌的葉酸合成,抑制細(xì)菌生長和繁殖。對溶血性鏈球菌、肺炎桿菌、淋球菌、葡萄球菌、腦膜炎球菌、大腸桿菌及痢疾桿菌等有抗菌作用。用于敏感菌所致的肺炎、出血性敗血癥、子宮內(nèi)膜炎及禽霍亂、雛白痢等。對感染創(chuàng)可外用其軟膏劑。同時(shí)也被用作飼料添加劑,增肥犢牛和豬。19精選ppt磺胺噻唑內(nèi)服吸收不完全,馬、牛、豬、羊一次內(nèi)服0.1mg/kg,其血藥峰濃度僅為20mg/L。其可溶性鈉鹽肌肉注射后迅速吸收。吸收后排泄迅速,單胃動(dòng)物內(nèi)服后,在12h內(nèi)經(jīng)腎排出約50%,24h約90%。其半衰期短,不易維持有效血濃度。在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合率和乙酰化程度均較高,其乙?；锶芙舛缺仍幍?易產(chǎn)生結(jié)晶尿而損害腎臟。20精選ppt巴喹普林巴喹普林(BQP)是一種新型動(dòng)物專用的磺胺類藥物,最早由美國WellcomeFoundation公司于1989年創(chuàng)制,1991年美國MalhndRrodt公司將其與磺胺類藥物配成復(fù)方制劑上市。BQP抗菌譜與其他磺胺類藥相近,同時(shí)又是磺胺等抗菌藥物的增效劑。主要用于牛的肺炎及腸炎、腐蹄病、臍部感染、感染性外傷、感染性角膜結(jié)膜炎、非泌乳期牛的木舌病和放線菌下頜腫塊;豬胃及腸道感染、胸膜肺炎、乳腺炎、子宮炎、無乳綜合癥等;狗的泌尿系、呼吸系、胃腸道及皮膚感染。21精選ppt巴喹普林內(nèi)服生物利用度高且分布廣泛、體內(nèi)的消除半衰期長。豬肌注的休藥期為28天,牛肌注和內(nèi)服的休藥期分別為28天和21天。奶牛用藥后的棄乳期為4天。主要經(jīng)膽汁和腎排泄。豬、牛用藥后14~42天,肝、腎和注射部位的母藥殘留在總殘留中占很低的百分比,同時(shí)肌肉和脂肪的殘留量低于檢測方法的測定限。豬皮中含相當(dāng)高的母藥殘留,而且降解和消除都比?？?殘留量相應(yīng)亦低。22精選ppt二、樣品處理常用的磺胺類藥物,除少數(shù)外,一般具有以下的根本結(jié)構(gòu):磺酰胺基其化學(xué)性質(zhì)可從四局部結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出來,即:磺酰胺基(—SO2NHR)、芳伯氨基(—NH2)、芳環(huán)、N1及N4上的取代基。(R′=H),兩性化合物,可溶于酸或堿溶液。磺酰氨基的酸性表現(xiàn)在N1上的活潑氫原子,其酸性的大小取決于N1上的取代基R。R的吸電性越大,那么其酸性越強(qiáng)。23精選ppt化學(xué)性質(zhì)本類藥物水溶性較低,易溶于極性有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、乙腈、氯仿和二氯甲烷,難溶于非極性有機(jī)溶劑。由于磺胺藥具有酸堿兩性,通過調(diào)節(jié)溶液的pH值(pH7~9),可以使磺胺藥呈不同狀態(tài),即中性分子還是離子分子,從而改變水相和有機(jī)相的分配系數(shù)。例如,磺胺的中性分子,在二氯甲烷等有機(jī)溶劑中分配系數(shù)大;離子態(tài)分子,那么水性溶液中分配系數(shù)大。生物樣品通過屢次液-液萃取,可到達(dá)凈化的目的。24精選ppt1、提取液體樣品(如牛奶)可用水稀釋過濾后,熒光直接檢測,亦可用水性緩沖液或氯化鈉溶液稀釋,再進(jìn)行凈化處理。蜂蜜樣品可用水或水性緩沖液稀釋。組織樣品(如肌肉、腎臟、肝臟)的預(yù)處理相對復(fù)雜些,一般采取均質(zhì)、液-液萃取或固相萃取凈化等步驟。液-液萃取操作煩瑣,而蛋白沉淀后直接進(jìn)樣,雖操作簡便、并具有較高的回收率,但對色譜柱的損害較為嚴(yán)重。25精選ppt溶劑提取溶劑提取時(shí),應(yīng)盡可能使組織中結(jié)合態(tài)的殘留物溶解,并且除去大局部的蛋白質(zhì)。一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或混合溶劑等極性溶劑進(jìn)行提取。二氯甲烷中參加離子對試劑四丁基銨(pH10),對魚肉和動(dòng)物組織的提取,發(fā)現(xiàn)磺胺二甲氧嘧啶和奧美普林的提取率很高。另外,提取過程中參加無水硫酸鈉可脫去組織樣品中的水分,有助于樣品的充分提取。26精選ppt2、凈化初提取液中含大量的內(nèi)源性干擾雜質(zhì),在痕量分析時(shí)會(huì)干擾組分的測定,因此還需要凈化處理。凈化方法有液-液萃取、固相萃取、基質(zhì)固相分散、在線痕量富集、液相色譜、在線透析和超臨界流體萃取等。有時(shí)為了獲得高的凈化效果,幾種方法相結(jié)合應(yīng)用。27精選ppt液-液萃取液-液萃取盡管操作煩瑣、消耗溶劑,但在所有凈化方法中應(yīng)用最廣。通過調(diào)節(jié)樣液的pH值,使磺胺類藥物有選擇性地在有機(jī)相與水相之間進(jìn)行分配。例如,有機(jī)相提取液中的磺胺類藥物可以被強(qiáng)酸溶液或堿性溶液抽提,假設(shè)將水相提取液調(diào)節(jié)pH至5.1~5.6,可用二氯甲烷或乙酸乙酯進(jìn)行再抽提。離子對提取法亦有應(yīng)用,例如,水相提取液調(diào)節(jié)pH至10~11,參加四丁基銨離子對試劑,形成磺胺類離子對,可以被二氯甲烷提取。用正己烷或乙醚進(jìn)行液-液萃取,可以脫脂肪。28精選ppt固相萃取由于甲氧芐啶常和其他磺胺藥物同時(shí)使用,而它們具有不同的pKa和溶劑親和力,難以在給定的pH值和溶劑系統(tǒng)中同時(shí)提取,宜采用固相萃取法(SPE)。常用的SPE柱,如C18和C8、硅膠柱、離子交換柱、Florisil柱和堿性氧化鋁柱等。該法操作較為簡便、并對生物樣品具有較高的“凈化〞能力,可提高方法的提取回收率和精密度。亦可將幾種小柱串聯(lián)應(yīng)用,可獲得更高的凈化效果?；|(zhì)固相分散法目前只使用C18吸附劑,該方法簡便、提取率和凈化能力均高,已應(yīng)用于魚肉、牛肉、豬肉和牛奶樣品的預(yù)處理。29精選ppt柱切換技術(shù)在線痕量富集技術(shù)可別離/凈化牛奶樣品中9種磺胺類藥物：磺胺類藥物在預(yù)富集柱RP-C18(10μm)中被保存濃縮,干擾雜質(zhì)用淋洗劑洗去后,預(yù)柱中的磺胺類藥物再用洗脫液洗脫,進(jìn)入分析柱中別離。有研究者將TSK凝膠滲透柱和PLRP-S預(yù)富集柱串聯(lián)使用,用于凈化豬組織中的磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑和甲氧芐啶。30精選ppt在線透析采取在線透析、富集的方法,可測定動(dòng)物源食品(肌肉、牛奶和蛋)中的13種磺胺類藥物：利用纖維素膜選擇性滲過分析物,到達(dá)預(yù)富集柱(C18、XAD-2或XAD-4),干擾雜質(zhì)用淋洗劑洗去,濃縮后的分析物被洗脫后,進(jìn)入分析柱別離。31精選ppt超臨界流體萃取超臨界流體萃取法被用于豬腎臟樣品中甲氧芐啶和3種類固醇激素的提取別離。CO2提取時(shí),分析物被保存在柱的進(jìn)樣端,大局部內(nèi)源性干擾物被洗去后,分析物和一些極性干擾物用參加改性劑的CO2洗脫。32精選ppt三、分析方法生物樣品中磺胺類藥物的分析,光譜法(分光光度法、熒光光譜法)和色譜法〔薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、超臨界流體色譜〕具有靈敏、快速、方便等優(yōu)點(diǎn)。例如：分光光度法測定牛組織中的磺胺甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑，奶中的乙?；前?、N-乙?；前范奏奏?；薄層色譜法測定動(dòng)物組織、豬肝、奶中的磺胺甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑。33精選ppt1、光譜法光譜法主要用于樣品中個(gè)別磺胺類藥物的分析,最常用的方法為重氮化-偶合反響分光光度法。無N4取代基的磺胺類藥物,或N4為酰氨基的磺胺類藥物,經(jīng)水解,在酸性介質(zhì)中經(jīng)重氮化后,可在堿性中與酚類(如β-萘酚、麝香草酚)偶合,在中性中與變色酸偶合,或在弱酸性中與胺類偶合呈色,于空白校正下,在一定波長處測其吸收度。與標(biāo)準(zhǔn)品對照,即可測定其含量。最常應(yīng)用的是酸性偶合試劑,如N-(1-萘基)乙二胺(BrattonMarshall方法),測定波長隨組分的不同略有不同,一般為540~545nm,已應(yīng)用于牛組織和奶中的磺胺二甲嘧啶檢測、蜂蜜中的磺胺噻唑檢測。34精選ppt也有應(yīng)用1-(β-二乙氨基-乙基-氨基)萘,優(yōu)點(diǎn)為偶合形成的偶氮染料是水溶性的,且其吸收系數(shù)也較大。這兩種偶合試劑遇亞硝酸都能變色,所以,經(jīng)重氮化后,應(yīng)以氨基磺酸鹽將剩余的亞硝酸分解除去。光譜法選擇性差,但可作為一種篩選法應(yīng)用,如牛奶中磺胺醋酰和磺胺脒啶的篩選測定。35精選ppt2、薄層色譜法薄層色譜(TLC)經(jīng)常作為樣品篩選方法。經(jīng)薄層色譜別離后的磺胺類藥物,可按兩種方法進(jìn)行定量分析：洗脫定量法和薄層掃描定量法。洗脫定量法：從板上洗脫后,可按分光光度法,或與熒光胺、對二甲氨基苯甲醛反響后的比色法,或重氮化-偶合后的比色法進(jìn)行。其中,以重氮化-偶合法最好。但與實(shí)際相比,測得值尚低5%~15%。結(jié)果偏低的主要原因是薄層色譜條件不穩(wěn)定,吸附劑可能局部損失。板上洗脫后重氮化-偶合法如下:36精選ppt刮下的薄層用1mol/LHCl10mL提取,所得提取液先加0.1%NaNO2液1mL,5min后,再加0.5%氨基磺酸銨液1mL,強(qiáng)烈振搖后,參加0.1%N,N-乙基-N′(1-萘基)乙二胺草酸鹽溶液1mL,10min后,用3cm的吸收池,以同法所得的試劑空白為對照,于546mm處(SMP、SIZ、ST的λmax)或542nm處[為SM2′、SPZ(磺胺苯吡唑〕的λmax]進(jìn)行測定。37精選ppt薄層掃描定量法薄層掃描法〔TLCS〕系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。隨著制板、點(diǎn)樣、展開等操作的儀器化及儀器性能的改進(jìn)，薄層掃描法檢測的靈敏度，結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度均大大提高。與高效液相色譜法相比，具有多通道效應(yīng)，可同時(shí)平行別離分析多個(gè)樣品；流動(dòng)相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對樣品的預(yù)處理要求不高等優(yōu)點(diǎn)。38精選ppt應(yīng)用TLC紫外分光光度法進(jìn)行磺胺類藥物定量分析時(shí),有7%~11%的損失。如用無黏合劑的硅膠,以0.1mol/LNaOH調(diào)糊制板,可以獲得較好的回收率。TLC的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、可以同時(shí)在多塊板上點(diǎn)樣,處理大量樣品時(shí)間短,適合飼料、組織、體液樣品的篩選分析。39精選ppt3、氣相色譜法氣相色譜法(GC)具有高的靈敏度和選擇性,但由于磺胺類藥物難揮發(fā),測定時(shí)需要衍生化。一般用重氮甲烷甲基化,或甲基化后再用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)進(jìn)行硅烷化或N-甲基雙(三氟乙酰胺)(MBTFA)乙?；?以增加揮發(fā)性,改善色譜特性(熱穩(wěn)定性、降低極性),氫火焰離子化檢測器測定。除了甲基化外,也可利用水解法將磺胺類藥物水解成相應(yīng)的揮發(fā)性胺類,繼之以GC法測定,也可與適宜的鹵化試劑反響,生成相應(yīng)的衍生物,如三氟乙酰化或七氟丁?；苌锏?以電子捕獲檢測器測定。40精選pptGC別離柱磺胺類藥物的別離柱可用填充柱和石英毛細(xì)管柱,通常毛細(xì)管柱(DB-5)別離效果更好。樣品確證分析時(shí),一般用質(zhì)譜檢測器測定,離子源采用化學(xué)電離和電子轟擊接口。多數(shù)磺胺類藥物含有對氨基苯磺?；Y(jié)構(gòu)局部,它們的結(jié)構(gòu)差異只是N1取代基的不同,所以本類藥物的質(zhì)譜有許多共有的特征峰,如m/z56、l40、108、92、65和39等碎片離子峰。41精選ppt4、超臨界色譜法Ramsey等用超臨界流體色譜法測定豬腎組織中的甲氧芐啶和三種類固醇激素,分析柱為Spherisorb5氨基鍵合柱,含甲醇的CO2作流動(dòng)相,熱噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測器測定,檢測限約10mg/kg,對于組織和奶中μg/kg級殘留量的檢測,靈敏度不夠。42精選ppt5、高效液相色譜法20世紀(jì)80年代以來,普遍采用反相色譜法,使用C18、C8和苯基柱,尤以C18應(yīng)用最廣,以甲醇(或乙腈)-水(含醋酸或偏磷酸)系統(tǒng)為流動(dòng)相,可別離檢測數(shù)種磺胺類藥物及其代謝物,樣品可用甲醇或堿性緩沖液溶解制備。流動(dòng)相中參加適量戊磺酸、己磺酸和辛磺酸離子對試劑,可以改變磺胺類藥物的保存時(shí)間和改善峰形。HPLC的洗脫方式,一般采用等度洗脫,假設(shè)需同時(shí)檢測數(shù)種磺胺類藥物或多種代謝物,可采用梯度洗脫,通過改變流動(dòng)相流速或配比,實(shí)現(xiàn)在較短的時(shí)間內(nèi)對生物樣品中混合組分或代謝物的別離。43精選ppt由于甲氧芐啶分子結(jié)構(gòu)中不含磺酰胺結(jié)構(gòu),其堿性較其他磺胺類藥物強(qiáng),在HPLC別離檢測時(shí),在ODS柱上會(huì)產(chǎn)生一定的拖尾現(xiàn)象,可采用反相離子對色譜法,以十二烷基磺酸或四丁基銨鹽作為反離子,也可使用掃尾劑三乙胺改善其拖尾現(xiàn)象。但離子對色譜法對色譜柱有一定的損害作用,應(yīng)予注意。44精選ppt有些用通常的HPLC法難以別離的磺胺類藥物,使用β-環(huán)糊精化學(xué)鍵合固定相很容易到達(dá)別離。其別離原理,是基于當(dāng)磺胺藥物分子接近或透入到β-環(huán)糊精疏水腔內(nèi)時(shí)可形成包合物,改變了磺胺類藥物分子的某些理化性質(zhì)。包合物的穩(wěn)定性與磺胺類藥物分子和β-環(huán)糊精分子的大小有關(guān),與β-環(huán)糊精作用強(qiáng)的磺胺類藥物洗脫較難,有較長的保存時(shí)間;與β-環(huán)糊精作用弱的磺胺類藥物洗脫容易,有較短的保存時(shí)間,據(jù)此,可將磺胺類藥物別離。本法選擇的流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH7.0)-甲醇(85+15),可別離7種磺胺類藥物的混合物。45精選ppt紫外檢測器磺胺類藥物在250~290nm波長區(qū)間有強(qiáng)的紫外吸收,因此HPLC的在線檢測,一般采用紫外檢測。為提高檢測靈敏度,可使用對二甲氨基苯甲醛(DMAB)柱后衍生化,于450nm處紫外-可見光檢測,已應(yīng)用于蛋、奶和肌肉組織中13種磺胺類藥物的測定,以及動(dòng)物組織中6種磺胺類藥物的測定。46精選ppt熒光檢測器磺胺類藥物本身具有弱的熒光特性,但熒光檢測時(shí)還需要熒光衍生化。常用的熒光衍生劑有鄰苯二甲醛(OPA)、熒胺和巰基乙醇等。磺胺類藥物與OPA或其衍生物(如4-羥基-鄰苯二甲醛)在酸性介質(zhì)中反響呈現(xiàn)藍(lán)色熒光,檢出量可達(dá)1×10-9~8×10-8mol/mL的濃度范圍。47精選ppt熒胺作為熒光衍生劑,可選擇性地用于具有脂肪族伯胺基團(tuán)藥物共存時(shí)芳伯胺藥物的微量測定,其檢測限量可達(dá)0.8×10-9mol/mL。此外,也有人采用2,6二氨基吡啶作為熒光衍生劑,其檢出量可達(dá)10-9~10-10mol/mL。衍生化方式有柱前衍生化和柱后衍生化。48精選ppt電化學(xué)檢測器亦可使用電化學(xué)檢測器,但在尿中甲氧芐啶代謝物的測定中,與紫外檢測比較,電化學(xué)檢測器的檢測靈敏度并無顯著提高,且不能同時(shí)檢測甲氧芐啶。假設(shè)需同時(shí)檢測甲氧芐啶,可通過提高工作電位實(shí)現(xiàn),但此時(shí)檢測靈敏度將顯著下降。49精選ppt例子1Horie等報(bào)道了蜂蜜中10種磺胺類藥物的LC-UV測定方法。5g蜂蜜樣品中參加50mL30%氯化鈉溶液,用二氯甲烷提取,提取液中參加無水硫酸鈉脫水,過Sep-PakFlorisil固相萃取柱,用10mL乙腈-二氯甲烷(2+8)淋洗,用10mL甲醇-二氯甲烷(2+8)洗脫,濃縮至干,用1mL流動(dòng)相溶解,進(jìn)樣。色譜柱為LiChrosphereRP-18e(25cm,5μm),以0.05mol/L磷酸二氫鈉-乙腈(2+1)作流動(dòng)相,流速0.5mL/min,275nm處紫外檢測,能檢測到蜂蜜中磺胺類藥物濃度50μg/kg。50精選ppt標(biāo)準(zhǔn)品和蜂蜜樣品色譜圖1一磺胺噻唑;2一磺胺嘧啶;3一磺胺甲嘧啶;4一磺胺甲氧噠嗪;5一磺胺二甲嘧啶;6-磺胺間甲氧嘧啶;7一磺胺氯達(dá)嗪;8一磺胺甲蟋唑;9一磺胺喹嗯啉;10一磺胺二甲氧嘧啶