hplc法測定果汁中9種有機酸

hplc法測定果汁中9種有機酸

酸是果汁的主要成分。它的種類和含量與果汁的質(zhì)量和口感密切相關(guān)。有機酸的分析方法主要有:酸堿滴定法、氣相色譜法及高效液相色譜法等。酸堿滴定法只能測定總酸量;氣相色譜法需衍生步驟,且操作繁瑣;而高效液相色譜法在食品營養(yǎng)及毒物檢測中已發(fā)揮了重要的作用,具有操作簡便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點,可同時定量測定多種有機酸,在一定條件下,可以通過測定各種有機酸的含量來鑒別果汁飲料摻假與否。本文利用反相高效液相色譜法對果汁中9種有機酸進行了分析,結(jié)果穩(wěn)定、可靠。1材料和方法1.1儀器和色譜管理機制1100系列高效液相色譜儀,包括四元泵(G1311A)、在線真空脫氣機(G1379A)、紫外檢測器(G1314A)、柱溫箱(G1316A)、自動進樣器(G1313A)和ChemicalStation色譜工作站(美國Agilent公司);Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);MP220型酸度計(瑞典Mettler-Toledo公司)。1.2標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液配制磷酸氫二銨(AR);草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、抗壞血酸、檸檬酸、富馬酸、反烏頭酸(sigma公司);乙酸(HPLC);實驗用水均來自Milli-Q純水系統(tǒng)。酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乙酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的配制(10.0mg/ml):分別精密稱取酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乙酸、檸檬酸0.1000g于10ml容量瓶中,用水溶解并定容至刻度。草酸、丙酮酸、富馬酸、反烏頭酸(1.0mg/ml):分別精密稱取草酸、丙酮酸、富馬酸、反烏頭酸0.1000g于100ml容量瓶中,用水溶解并定容至刻度。流動相:0.01mol/L磷酸氫二銨:稱取1.32g磷酸氫二銨,加水溶解,并定容至1000ml,過0.45μm濾膜。用20%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.6,超聲脫氣。蘋果汁和葡萄汁飲料均購自超市(產(chǎn)地為四川、上海、淮安和杭州)。1.3磷酸氫二銨法色譜柱:GeminiC18(250mm×4.6mm×5μm);柱溫:30℃;紫外檢測波長:210nm;流動相:0.01mol/L磷酸氫二銨溶液(pH2.6);流速:1.0ml/min;進樣體積:10.0μl。1.4線性回歸c,gc臨用時分別將標(biāo)準(zhǔn)貯備液用水稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:草酸1.0～400mg/L、酒石酸2.0～500mg/L、丙酮酸1.0～500mg/L、蘋果酸5.0～2000mg/L、抗壞血酸1.0～400mg/L、乙酸8.0～2000mg/L、檸檬酸5.0～2000mg/L、富馬酸0.5～100mg/L、反烏頭酸1.0～400mg/L,進樣10.0μl,按1.3項色譜條件進行檢測,以峰面積(A)對濃度(C,mg/L)進行線性回歸。1.5hplc分析取果汁樣品5.0ml于10ml比色管中,加水定容至刻度,混勻,經(jīng)0.45μm濾膜過濾至自動進樣器樣品瓶中,供HPLC分析。2結(jié)果和討論2.1有機酸的紫外吸收對9種有機酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行200～400nm范圍的紫外掃描,結(jié)果表明9種有機酸均在210nm附近有較大的吸收,故采用210nm波長進行檢測。2.2有機酸的分離由于分離有機酸采用的流動相pH為2～3,需要色譜柱能耐較低pH。文獻報導(dǎo)采用KromasilC18柱分離有機酸,也有用ProntosilC18色譜柱分離有機酸,由于本實驗采用的流動相pH為2.6,故采用現(xiàn)有的GeminiC18色譜柱(pH使用范圍為1～12)分離9種有機酸,達到滿意的分離效果。2.3流動相ph的選擇本研究試驗的草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、抗壞血酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸和反烏頭酸等有機酸在水溶液中都有較大的離解度。在水相中大部分以離子形式存在,而酸根陰離子在反相色譜柱上幾乎無保留。故本試驗采用抑制電離的方法,使有機酸根陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿討B(tài)的酸在柱子上保留而得到分離。在酸性(pH2～3)流動相條件下,上述有機酸的離解得到抑制,利用有機酸分子的疏水性,使其在ODS色譜柱中保留?？刂屏鲃酉鄍H在2.6左右能減少色譜峰的拖尾,并可改善峰形,提高分離的選擇性。由于較高濃度的鹽緩沖溶液易造成對泵和柱子的堵塞或磨損,而低濃度的鹽緩沖溶液又不利于各有機酸的分離和流動相pH的控制。本文試驗了多種濃度的磷酸氫二銨緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH=2.6),結(jié)果表明,0.01mol/L的磷酸氫二銨緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH=2.6)具有較好的分離效果。故選擇0.01mol/L的磷酸氫二銨緩沖液(pH=2.6)作流動相。另外,本文曾在0.01mol/L磷酸氫二銨緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH=2.6)流動相中加入3%甲醇,盡管可以縮短分析時間,但丙酮酸和蘋果酸卻未能達到基線分離,在GeminiC18色譜柱上用0.01mol/L磷酸氫二銨緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH=2.6)作流動相分離9種有機酸,達到較好分離。有機酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖1。9種有機酸的濃度分別為草酸40mg/L、酒石酸200mg/L、丙酮酸80mg/L、蘋果酸800mg/L、抗壞血酸160mg/L、乙酸800mg/L、檸檬酸800mg/L、富馬酸10mg/L、反烏頭酸16mg/L。2.4加標(biāo)回收率試驗和方法取同一果汁樣品各5.0ml于24支10ml刻度比色管中,6支一組,其中3組每組分別加入不同濃度的有機酸標(biāo)樣,一組作為空白,再分別加水定容至10.0ml,經(jīng)0.45μm濾膜過濾至自動進樣器樣品瓶中,按1.3項色譜條件分析。通過加入有機酸的測得值計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表1,典型加標(biāo)色譜圖見圖2。由表1數(shù)據(jù)表明,該方法的回收率在93.7%～109.0%,RSD均小于5.0%;由圖2可知,各加標(biāo)物在色譜中得到較好的分離和響應(yīng),獲得了滿意的結(jié)果。2.5檢測限和定量限分別配制不同濃度的有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按法測定后,計算出不同濃度的峰面積,并進行線性回歸,以3倍信噪比S/N=3,計算檢測限,結(jié)果見表2。2.6測定物的測定結(jié)果樣品按1.5試樣制備的方法處理,并按1.3色譜條件