豬IEC酵母cDNA文庫的構(gòu)建及與PEDV結(jié)構(gòu)蛋白互作蛋白的篩選中期報告

豬IEC酵母cDNA文庫的構(gòu)建及與PEDV結(jié)構(gòu)蛋白互作蛋白的篩選中期報告一、研究背景和意義2020年初至今，全球爆發(fā)的COVID-19疫情引起了人類對于動物傳染病的警覺。動物病原體的傳遞已經(jīng)成為全球性問題。豬源性禽流感病毒(AV-PRRSV)、非洲豬瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)以及豬源性冠狀病毒(PEDV)等病原體引起的豬病毒性疾病更是給豬產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其對于豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。PEDV是一種非常重要的豬源性冠狀病毒，其在全球范圍內(nèi)廣泛流行，并對于豬的腸部及生產(chǎn)性能產(chǎn)生了明顯的損害。PEDV的限制性依賴性進(jìn)入（restrictedentry）機(jī)制與其他冠狀病毒有顯著的區(qū)別，且仍不存在有效的控制該病毒的手段。在了解PEDV的病理機(jī)制和抗PEDV的分子機(jī)制的基礎(chǔ)上，開發(fā)對PEDV有效的免疫技術(shù)，闡明PEDV與宿主的互作關(guān)系已成為當(dāng)前PEDV相關(guān)研究的熱點之一。本研究計劃建立豬IEC酵母cDNA文庫，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出PEDV結(jié)構(gòu)蛋白的互作蛋白，以期為PEDV限制性依賴性進(jìn)入的機(jī)制及防治提供研究基礎(chǔ)。二、研究方法和步驟1.建立豬IEC酵母cDNA文庫（1）提取IEC全RNA：本實驗采用Trizol法提取IECmRNA，質(zhì)量鑒定后進(jìn)行DNaseI消化。（2）合成一鏈cDNA：以消化后的mRNA為模板，利用SpecializedcDNASynthesisKit利用T25VCprimer進(jìn)行一鏈cDNA的合成。該反應(yīng)體系總體積20μl，反應(yīng)時間45分鐘；（3）合成雙鏈cDNA：用Trizol法提取一鏈cDNA，以此作為模板利用SMARTPCR把頭別分子擴(kuò)增器進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積50μl，PCR程序為：階段一：95℃5min;階段二：95℃30s>65℃30s>72℃1min;階段三：95℃30s>68℃10min>4℃∞；（3個循環(huán)）。以上程序重復(fù)24個周期。（4）構(gòu)建pGADT7-RecA載體：將RecA基因序列從E.coli中擴(kuò)增后，復(fù)制連接并鑒定，然后將其在pGADT7載體中插入。將pGADT7-RecA載體與線性的酵母表達(dá)載體pGBKT7進(jìn)行平面配對，之后將其共同轉(zhuǎn)化入酵母菌株Y2HGold中。2.利用酵母雙雜交技術(shù)篩選PEDV結(jié)構(gòu)蛋白的互作蛋白（1）篩選條件：以pGADT7-RecA和pGBKT7-PEDV結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的雙雜交表達(dá)系統(tǒng)為模型，通過篩選PEDV結(jié)構(gòu)蛋白與IEC酵母cDNA文庫中的脫靶蛋白互作，篩選條件為：雙營養(yǎng)反應(yīng)平板上補充SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和X-AlphaGal的根基板。（2）獲得陽性克隆：在篩選平板上生長后，觀察是否有β-Galactosidase發(fā)生作用，無論是否有明顯的生長，均采用PCR鑒定，將通過PCR鑒定的陽性克隆測序。三、研究進(jìn)展1.建立豬IEC酵母cDNA文庫已完成采集IEC樣本，提取IECrRNA，并已經(jīng)進(jìn)行DNaseI消化。同時開展了一鏈cDNA合成實驗和雙鏈cDNA的合成實驗，并已將雙鏈cDNA連接到pGADT7-RecA載體中。2.篩選PEDV結(jié)構(gòu)蛋白的互作蛋白PEDVnucleocapsidprotein(NP)和spikeprotein(S)被認(rèn)為是PEDV進(jìn)入宿主細(xì)胞和感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因素。因此，本實驗選擇PEDV-NP和PEDV-S作為篩選的目標(biāo)蛋白。目前，我們已經(jīng)獲得了包含PEDV-NP或PEDV-S的pGBKT7載體，并構(gòu)建了與之相對應(yīng)的pGADT7-RecA載體。同時，我們已經(jīng)將pGADT7-RecA載體與線性載體pGBKT7共同轉(zhuǎn)化入酵母菌株Y2HGold中開始篩選。目前我們正在對所得到的酵母菌體進(jìn)行篩選并進(jìn)行PCR鑒定以確定是否有PEDV結(jié)構(gòu)蛋白的互作蛋白。四、未來計劃根據(jù)實驗結(jié)果，我們將確定是否有與PEDV結(jié)構(gòu)蛋白互作的蛋白，并初步探討這些蛋白在P