分子醫(yī)學(xué)技能課件-分子醫(yī)學(xué)技能-實(shí)驗(yàn)二

實(shí)驗(yàn)二

PCR檢測乙肝病毒

PCR分析apoB基因多態(tài)性PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖乙肝病毒PCR實(shí)驗(yàn)操作apoB基因PCR多態(tài)性分析血清樣本處理（模板的制備）PCR檢測乙肝病毒PCR反應(yīng)上機(jī)口腔細(xì)胞總DNA（模板）apoB基因PCR實(shí)驗(yàn)操作PCR反應(yīng)上機(jī)實(shí)驗(yàn)安排PCR基本原理及相關(guān)知識ThePolymeraseChainReactionSometimescalled"molecularphotocopying,"thepolymerasechainreaction(PCR)isafastandinexpensivetechniqueusedtoamplify,ormakemanycopiesof,smallsegmentsofDNA.Thetechnologyempowersscientiststoundergoanumberofprocesses,fromDNAfingerprintingtomappingthehumangenome.In1983,KaryMullisinventedthePCR.Theprocessisaninvaluabletooltotoday'smolecularbiologistsandbiotechnologycorporations.KaryB.MullisAshewrotelaterinScientificAmerican:"BeginningwithasinglemoleculeofthegeneticmaterialDNA,thePCRcangenerate100billionsimilarmoleculesinanafternoon.Thereactioniseasytoexecute.Itrequiresnomorethanatesttube,afewsimplereagentsandasourceofheat."(1944-)TheNobelPrizeinChemistry1993forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method（1/2oftheprize

）3stepand30cyclesforPCRStep1.DenaturationStep2.AnnealStep3.Extend30cyclescreateoverabillioncopiesofthesequenceStep1.Denaturation（變性）Thereactionisfirstheatedtodenature(separate)thesidesofthedouble-strandedDNATemperature:~95degreesCelsius

Step2.Anneal（退火）thencooledtoallowtheprimerstofindandbindtotheircomplementarysequencesontheseparatedstrands.Temperature:~55degreesCelsius

Step3.Extend（延伸）thepolymerasetoextendtheprimersintonewcomplementarystrands.Temperature:~75degreesCelsius

RepeattheCyclesRepeatedheatingandcoolingcyclesmultiplythetargetDNAexponentially,sinceeachnewdoublestrandseparatestobecometwotemplatesforfurthersynthesis.Thisprocesscanthenberepeatedupto30timestocreateoverabillioncopiesofthesequence.1個(gè)循環(huán)后的結(jié)果第2個(gè)循環(huán)后的結(jié)果模版第1次的產(chǎn)物第2次的產(chǎn)物AABBCD第3個(gè)循環(huán)后的結(jié)果第3次的產(chǎn)物第4個(gè)循環(huán)后的結(jié)果第4次的產(chǎn)物1A，1B，2C，2D，2EAB2C2D2E1A，1B，3C，3D，6（22+2）EAB3C3D6E第N個(gè)循環(huán)后的結(jié)果第N次的產(chǎn)物1A，1B，（N-1）C，（N-1）D，(2n-2+2)

E……(2n-2+2)

EABN-1CN-1DComponentsforPCRReactionTemplate(dsDNA)Primers(TWOshortDNA:15-30nucleotidesinlength.Longerprimersprovidehigherspecificity

)P22Taqpolymerase（Thermusaquaticus）dNTPMix(dATP,dGTP,dTTP,dCTP)ReactionBuffer(includingMg2+)10×PCR反應(yīng)緩沖液（buffer）：

已作成商品化的產(chǎn)品，它包括：250~500mmol/LKCl；

100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；

15~20mmol/LMgCl2（對Taq酶的活性影響很大，一般濃度為1.5~2.0mmol/L，實(shí)際應(yīng)用時(shí)根據(jù)反應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整）；

0.1%明膠或牛血清白蛋白

影響PCR的主要因素①

PCR反應(yīng)體系的各個(gè)組分模板的質(zhì)量、引物的設(shè)計(jì)、Taq酶的活性②

PCR循環(huán)的溫度與時(shí)間預(yù)變性、變性、退火、延伸③

PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺效應(yīng)④

操作環(huán)境避免污染

一般PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：樣品反應(yīng)不同的退火溫度梯度不同的Mg2＋濃度不同的模板濃度陰性對照反應(yīng)陽性對照反應(yīng)PCR方法的特點(diǎn)：操作簡便、時(shí)間短、特異性高、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)；廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、分子生物學(xué)、分子克隆、基因診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。二、PCR試劑盒檢測HBVDNA

實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)

HBV檢測試劑盒介紹構(gòu)成：DNA提取液檢測反應(yīng)管（PCR反應(yīng)體系，上樣buffer，石蠟油）陽性模板設(shè)計(jì)：反應(yīng)管中有針對HBV的特異性引物，若出現(xiàn)與陽性對照相同的結(jié)果，則說明待測樣品中含有HBVPCR實(shí)驗(yàn)具體操作1、待測血清中DNA簡單制備待測血清40ml+

40mlDNA提取液，混勻

沸水浴10min，10000rpm×5min樣品模板（用做檢測）無菌水40ml+

40mlDNA提取液

沸水浴10min，10000rpm×5min上清空白模板（做陰性反應(yīng)）上清實(shí)驗(yàn)分組陽性反應(yīng)1個(gè)陰性反應(yīng)1個(gè)樣品檢測反應(yīng)4個(gè)陽性模板2ul空白模板2ul樣品模板2ul混勻，6000rpm×5s，上PCR儀93℃×3min預(yù)變性

94℃，30s55℃，30s72℃，30s

72℃保溫5min30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)程序：三、PCR檢測

人apoB基因多態(tài)性分析PCR實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康募邦A(yù)期結(jié)果目的：檢測來自不同樣本的基因多樣性檢測技術(shù)：apoB基因的PCR預(yù)期結(jié)果：瓊脂糖電泳條帶的差異apoB多態(tài)性分析的基本實(shí)驗(yàn)過程來源不同的待測樣本PCR擴(kuò)增目的基因瓊脂糖電泳結(jié)果比較分析實(shí)驗(yàn)主要步驟apoB基因PCR，1人1份分裝PCR反應(yīng)液每份