黃嘌呤氧化酶（xanthioneoxidase,XOD）試劑盒說明書

第第頁黃嘌呤氧化酶（xanthioneoxidase,XOD）試劑盒說明書黃嘌呤氧化酶（xanthioneoxidase,XOD）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差別較大的樣本做猜測定測定意義：XOD（EC1.17.3.2）催化黃嘌呤氧化生成尿酸和超氧陰離子，是活性氧重要來源之一；同時(shí)也是核苷酸代謝的關(guān)鍵酶之一、XOD重要分布于哺乳動物的心，肺，肝臟等組織中，當(dāng)肝功能受損時(shí)，XOD大量釋放到血清中，對肝損害的診斷具有特異性的意義。測定原理：XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸，尿酸在290nm下有特征汲取峰。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。試劑構(gòu)成和配制：提取液：100mL×1瓶，4℃保管；試劑一：30mL×1瓶，4℃保管；試劑二：粉劑×2瓶，4℃保管。粗酶液提取：1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。操作步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長至290nm，蒸餾水調(diào)零。2、XOD檢測工作液的配制：用時(shí)在每瓶試劑二中加入15mL試劑一，充分混勻，待用；現(xiàn)配現(xiàn)用；3、測定前將XOD檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。4、準(zhǔn)備96孔UV板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測波長小于340nm務(wù)必使用UV板）。5、在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和250μL工作液，立刻混勻并計(jì)時(shí)，記錄290nm下初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA＝A2A1。XOD活性計(jì)算：a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下1、血清（漿）XOD計(jì)算：單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=2131×ΔA2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中XOD計(jì)算：（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=2131×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=2131×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=4.26×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×104L；ε：尿酸摩爾消光系數(shù)，1.22×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下1、血清（漿）XOD計(jì)算：單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=4262×ΔA2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中XOD計(jì)算：（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=4262×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=4262×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。XOD（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=8.52×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×104L；ε：尿酸摩爾消光系數(shù)，1.22×104L/mol