牛子及其提取物對糖尿病大鼠腎臟gf

牛子及其提取物對糖尿病大鼠腎臟gf

對stz誘導(dǎo)的糖尿病大鼠進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)，并對大鼠動物模型進(jìn)行了觀察。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動物采用清潔級3月齡♂Wistar大鼠,購于上海動物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心清潔級動物室,體重在180～200g之間。1.2配制工藝,符合以下規(guī)定牛蒡子購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房,經(jīng)打粉、干燥、密封保存?zhèn)溆谩?000g以95%的乙醇提取為200mL醇提液,1000g粉劑制成200mL水提液,1000g與普通飼料4000g混勻,做成藥物飼料。1.3主試劑(1)模型試驗(yàn)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma公司。(2)pco及ndps異硫氰酸胍:Gibco公司。SuperScriptⅡ(SSⅡ)逆轉(zhuǎn)錄酶:Gibco公司。Oligo(dT):Promega公司。dNTPs(四種各100mM):Promega公司。TaqDNA聚合酶:Biostar公司及華美生物工程公司。胃蛋白酶(Difico公司)、Ⅳ型膠原酶(Sigma公司產(chǎn)品)。(3)引物的篩選(由上海博彩生物技術(shù)有限公司合成。)檢測大鼠TGF-β1的上游引物:TGF-UP:5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCCATGAC-3′,TGFβ1的下游引物:TGF-Down:5′-CTGCTCCACCTTCTTGGGCTTGCGACCCAC-3′;檢測大鼠MCP-1上游引物:MCP1-UP,5′-ATGCAGGTCTCTGTCACG-3′,MCP-1下游引物:MCP-1-down:5′-CTAGTTCTCTGTCATACT-5′;檢測大鼠β-Actin的內(nèi)參引物:上游β-Actin-UP:5′-TGGGACGATATGGAGAAGAT;下游引物:BActin-Down:5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT。(引物由上海博彩公司合成,引物用無菌水配制成50mM儲存)。1.4測試盒尿白蛋白放射免疫分析測定盒,北京北方生物技術(shù)研究所。糖化血紅蛋白試劑盒:Roche公司。1.5儀器、檢測設(shè)備OneTouchⅡ型血糖儀及其試紙:Lifescan公司。HITACH(日立)7170型自動生化分析儀,SN-682放射免疫γ計(jì)數(shù)器:中國科學(xué)院上海原子核研究所日環(huán)儀器廠。RNA/DNA定量檢測儀:Pharmacia公司。PCR儀:PE公司。電泳儀及水平式電泳槽:Bio-Rad公司。凝膠數(shù)碼成像儀及圖像分析系統(tǒng):AlphaInnotech公司。光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng):Nicon公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1動物的消毒照明大鼠飼養(yǎng)于本校實(shí)驗(yàn)動物中心清潔級動物室。實(shí)驗(yàn)期間,動物室溫度控制在21～25℃,12h交替照明。大鼠自由飲水、進(jìn)食,保持墊料干燥,每天換墊料2次。每籠大鼠不超過5只。2.2大鼠造模前后分組造模前將所有大鼠隨機(jī)分為2組;造模組和正常對照組(E組)。造模后選取符合模型標(biāo)準(zhǔn)的大鼠,隨機(jī)分為4組:A組:牛蒡子粉組;B組:牛蒡子水提組;C組:牛蒡子醇提組;D組:模型組。2.3枸杞酸緩沖液配制造模前大鼠禁食12h,鏈脲佐菌素(STZ)臨用前用0.1mol·L-1,pH4.0的枸櫞酸緩沖液配成1%的濃度,以55mg·kg-1體重的劑量,ip72h后檢測空腹血糖和尿糖水平,以血糖>16.7mmol·L-1且尿糖檢測在+++～++++以上作為模型入選。正常組予以等量的枸椽酸緩沖液。2.4含藥飼料含藥確定造模大鼠達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn)后,穩(wěn)定3d后開始ig用藥。A組每只鼠每日予12g含藥飼料(含生藥2.5g)后,可自由進(jìn)食。B、C組每只鼠每日予0.5mL藥液(相當(dāng)于2.5g生藥的提取物)ig,D、E組每只鼠予0.5mL自來水ig。每天統(tǒng)計(jì)各籠大鼠的飲水量,每周統(tǒng)計(jì)各籠大鼠的進(jìn)食量,每周稱量各大鼠的體重變化。2.5腎重/體重檢測用藥后第6周時用代謝籠收集大鼠24h尿液,離心,計(jì)總量,保存于-30℃冰箱中。第6周末稱量大鼠的體重,在無菌條件下,以戊巴比妥納40mg·kg-1ip麻醉大鼠,腹主動脈取血約6mL,分別用于血肌酐及血脂等生化指標(biāo)(2mL)、血常規(guī)及糖化血紅蛋白(2mL)檢測,所用的試管分別為普通管、肝素抗凝管。取雙腎稱重,用于計(jì)算腎重/體重比(即腎臟肥大指數(shù))。雙腎沿正中剖開,左腎置于10%中性福爾馬林液中固定,用于病理檢測;右腎置于液氮罐中,用于檢測TGF-β1和MCP-1mRNA的表達(dá)等。2.6外周血糖化血紅蛋白血肌酐、尿素氮等生化指標(biāo)采用日立7170型自動生化分析儀檢測。外周血糖化血紅蛋白(HbA1C)采用羅氏(Roche)診斷試劑有限公司的糖化血紅蛋白試劑盒檢測。尿肌酐采用堿性苦味酸法,尿蛋白用考馬斯亮蘭法。2.7腎組織tgf-i和mcp-1mna的檢測采用異硫氰酸胍法,具體步驟如下:2.7.1depc-1的制備(1)在RNasefree的1.5mL離心管中,加入2μg總RNA,0.5μLRNaseInhibitor(Promega),2μL100ng·mL-1Oligo(dT)15+18(15mer與18mer各50ng·mL-1,由上海博彩生物公司合成)和適量的DEPC處理的無菌水,使反應(yīng)的總體積為9.5μl?；靹?65℃保溫5min。取出室溫放置10min。短暫離心將溶液收集到管底。(2)按下列次序加入試劑,進(jìn)行RT反應(yīng):4μl5XFirstStrandBuffer(Gibco/BRL),0.5μlRNaseInhibitor(Promega),2μl100mMDTT(Gibco/BRL),2μl4XdNTPmixf(dATP,dCTP,dGTP,dTTP各10mM),1μ1200UMMLVReverseTranscriptase(Gibco/BRL)。(3)混勻,37℃保溫60min。(4)90℃處理5min,冰上冷卻,4℃離心將溶液收集到管底,RT產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增。2.7.2變性約系的制備(1)引物同上所述;(2)擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增條件如下:94℃45s,預(yù)變性120s,60℃退火45s,72℃延伸60s,循環(huán)35次,最后延伸300s。DNA擴(kuò)增結(jié)果檢測和半定量分析:DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1.6%的Agarose電泳和EB染色后用TanonGIS-1000數(shù)碼凝膠圖象分析系統(tǒng)分析。3資料統(tǒng)計(jì)分析本文中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用SPSSVersion10.0(SPSSInc.,2000)完成,其中各組均數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,資料統(tǒng)計(jì)采用One-WayANOVA法分析,方差不齊時采用DunnettT3法分析。統(tǒng)計(jì)顯著性水平為P<0.05。4結(jié)果4.1中藥對大鼠精神狀況的影響正常組大鼠體重增長明顯,精神狀況良好,動作自如,反應(yīng)靈敏,毛皮有光澤。DN模型組大鼠明顯消瘦,多飲多尿、精神萎靡,反應(yīng)遲鈍,毛豎無光澤,動作遲緩。中藥各治療組精神狀況均良好,動作自如,反應(yīng)靈敏度較正常組稍差。造模組及各用藥組大鼠進(jìn)食量、飲水量均較正常組顯著升高;各用藥組進(jìn)食量、飲水量均較模型組低。4.2各組大鼠血糖、糖化血紅蛋白水平血肌酐、尿素氮:模型組與正常對照組高,差異顯著(P<0.05),模型組比各用藥組高,但無顯著性差異。各用藥組之間無顯著性差異;牛蒡子醇提物組與正常組無顯著性差異。血糖:模型組及各組用藥組比正常組高(P<0.05)。各組用藥組之間無顯著性差異,P>0.05。各用藥組血糖水平均低于模型組,但與之無顯著性差異(P>0.05)。糖化血紅蛋白:模型組比正常組高(P<0.05);模型組比各用藥組高,但無顯著性差異(P>0.05);各用藥組之間及與正常組之間無顯著差異(P>0.05)。4.3對牛子醇提物治療大鼠血清中ndf的影響內(nèi)生肌酐清除率(CCr=尿肌酐/血肌酐×尿量mL):模型組>牛蒡子粉治療組>牛蒡子水提物治療組>牛蒡子醇提物治療組>正常組。中藥各治療組較模型組明顯降低(P<0.05)。牛蒡子醇提物治療組比牛蒡子粉治療組、牛蒡子水提物治療組均顯著降低(P<0.05)。24h尿蛋白:模型組>牛蒡子粉治療組>牛蒡子水提物治療組>牛蒡子醇提物治療組>正常組。中藥各治療組與模型組比較有明顯差異(P<0.05)。4.4組療效分析尿微量白蛋白(UAlb):模型組>牛蒡子粉治療組>牛蒡子水提物治療組>牛蒡子醇提物治療組>正常組。牛蒡子水提物治療組與牛蒡子醇提物治療組明顯低于模型組(P<0.05)。各治療組中,4周末時,牛蒡子醇提物組低于粉組及水提物組(P<0.05),6周末時,與牛蒡子粉組有顯著性差異(P<0.05)。4.5血清tgf-m1rna表達(dá)水平本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的產(chǎn)物大小與預(yù)期值一致:目標(biāo)片段TGFβ1400bp,MCP-1450bp;內(nèi)對照為Actin240bp。RT-PCR的電泳結(jié)果見圖1。TGF-β1mRNA表達(dá):模型組>牛蒡子粉治療組>牛蒡子水提物治療組>牛蒡子醇提物治療組>正常組。模型組比正常組高,差異顯著。各用藥組比模型組低,有顯著性差異;牛蒡子醇提治療組及牛蒡子水提組與正常組相比較無顯著性差異,此2組TGF-β1mRNA表達(dá)低于牛蒡子粉組,有明顯差異(P<0.05)。MCP-1mRNA表達(dá):模型組>牛蒡子水提物治療組>牛蒡子粉治療組>牛蒡子醇提物治療組>正常組。模型組較正常組及各用藥組高,差異顯著;牛蒡子醇提物治療組、牛蒡子粉治療組比牛蒡子水提物治療組低,差異顯著(P<0.05),牛蒡子醇提治療組與正常組相比較無顯著性差異。5討論5.1各組小鼠mcp-1表達(dá)比較MCP-1是最重要的趨化單核細(xì)胞在組織浸潤的細(xì)胞因子。MCP-1是主要趨化、激活巨噬細(xì)胞的趨化因子,研究認(rèn)為腎小球中單核細(xì)胞的浸潤與ECM的積聚及腎小球硬化癥的發(fā)展相關(guān)聯(lián),Rovin等研究表明DN時腎臟局部能合成MCP-1,且與腎小球損傷有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:牛蒡子醇提治療組可減輕MCP-1mRNA表達(dá),與正常組相比較無顯著性差異,與模型組、牛蒡子水提物差異顯著。提示牛蒡子提取物可能通過減輕MCP-1mRNA表達(dá)而改善糖尿病大鼠的腎損害。5.2大鼠ecm及tgf1基因表達(dá)變化眾多實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明:糖尿病大鼠及糖尿病腎病患者活檢組織TGFβ1mRNA的表達(dá)及蛋白含量均明顯升高,同時伴腎臟肥大和細(xì)胞外基質(zhì)增生,Shankland發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠2周時,其腎臟皮質(zhì)TGFβ1mRNA表達(dá)較正常大鼠高2-3倍。Nakamura觀察到糖尿病大鼠24周腎小球內(nèi)TGFβ1比正常大鼠高4倍。TGFβ1在DN發(fā)病中作用可概括為:促使腎臟肥大,增加系膜細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,并通過增加基質(zhì)降解酶抑制物的活性,抑制基質(zhì)降解酶合成,減少ECM的分解。研究證實(shí)糖尿病大鼠2周時,內(nèi)生肌酐清除率及腎重/體重均明顯高于正常組,同時伴有TGFβ1mRNA表達(dá)增加和TGFβ1蛋白表達(dá)增多。提示腎臟肥大及高濾過與TGFβ1升高密切相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)高糖本身及AngⅡ、AGES均有明顯刺激TGFβ1生成作用,近來研究表明,蛋白激酶活性升高同糖尿病大鼠TGFβ1過度表達(dá)有關(guān),可能同誘導(dǎo)c-fos、c-jun轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。大量研究表明,TGFβ1在促進(jìn)腎小球病變發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用,如調(diào)節(jié)腎小球固有細(xì)胞增殖,促進(jìn)ECM合成和分泌,改變基質(zhì)降解酶及其抑制因子的表達(dá)量和活性等。腎臟肥大可能與TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。TGFβ1可能為DN發(fā)病機(jī)制的最后通路:高血糖狀態(tài)下,有多種生化異常及微循環(huán)障礙共同參與DN的發(fā)生發(fā)展,包括蛋白激酶C的激活、蛋白非酶糖化、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增加等,它們可通過各種途徑參與TGFβ1的調(diào)節(jié),導(dǎo)致ECM積聚及腎小球硬化,其中高血糖、非酶糖化產(chǎn)物、NO以及血栓調(diào)節(jié)素對TGFβ1的作用與PKC的活性密切相關(guān)。它們都是通過或部分通過PKC來調(diào)節(jié)TGFβ。非酶糖化產(chǎn)物與TGFβ:糖化白蛋白(GA)能增加Ⅱ型TGFβ受體mRNA的表達(dá)。此外,在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中,AGES均可刺激TGFβmRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:各用藥組可減輕TGF-β1mRNA表達(dá),與模型組比較均有顯著性差異;牛蒡子醇提治療組及牛蒡子水提組與正常組相比較無顯著性差異,與牛蒡子粉組相比有明顯差異。5.3牛