糖尿病合并動脈粥樣硬化小鼠模型建立方法的探討

糖尿病合并動脈粥樣硬化小鼠模型建立方法的探討

隨著人口老齡化和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年增加。在糖尿病患者中,動脈粥樣硬化性疾病引起的死亡占總死亡率的80%,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是糖尿病患者中最多見的并發(fā)癥［1，2］。目前糖尿病合并As的病因及其各種并發(fā)癥的發(fā)病機制尚未完全闡明,需深入研究,理想動物模型的建立是實驗研究的基礎(chǔ)之一。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的模型制備方法主要有三大類,一是將糖尿病模型鼠與As模型鼠進行雜交［3］二是以糖尿病模型為基礎(chǔ)制備As模型［4-6］;三是以As模型為基礎(chǔ)制備糖尿病模型［3］。第一類方法費用高,而且受到實驗動物繁殖許可的限制,大多數(shù)實驗室不宜使用。第二類方法多采用對糖尿病鼠喂養(yǎng)高脂飼料,其動脈粥樣硬化的發(fā)生率和程度具有不確定性,難以把握和篩選。第三類方法相對簡單可靠,本研究就第三類方法中包含的幾種不同的建模方式進行了觀察和對比,以篩選出最佳的造模方法。1材料和方法1.1各組小鼠體重、stz的比較8周齡SPF級ApoE－/－雄性小鼠46只,購自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司,隨機分為對照組10只、高脂組8只、STZ低劑量組16只、STZ高劑量組12只,平均體重21.3g。鏈脲佐菌素(streptozoto-cin,STZ)購自Sigma公司,血糖儀及血糖試紙購自羅氏公司,血脂測定使用奧林巴斯全自動生化分析儀,基礎(chǔ)飼料購自成都達(dá)碩生物科技有限公司,檸檬酸緩沖液購自天津百浩生物科技有限公司。1.2stz低劑量組1.2次注射小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,空腹8h,測基礎(chǔ)體重及空腹血糖。對照組給予普通飼料;高脂組給予高脂飼料(脂肪21%、膽固醇0.15%)［7］。STZ用檸檬酸緩沖液配置,冰上操作,現(xiàn)配現(xiàn)用,并注意避光,配置好的液體用0.2μm微孔過濾器過濾,腹腔注射液體量為0.1~0.2mL,所有配置溶液在15min內(nèi)注射完畢。STZ低劑量組空腹12h后按55mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射STZ,連續(xù)注射5天［8］。STZ高劑量組空腹12h后按200mg/kg的劑量一次性腹腔注射STZ［9］。注射STZ后注意補足飼料和水,并短時間內(nèi)喂10%葡萄糖水(1周內(nèi)),之后繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料,每日更換墊料。1.3核心糖酸酯的理化性質(zhì)STZ末次注射后于第10天、21天測定空腹血糖。STZ末次注射2月后空腹8h測小鼠血糖,摘眼球取血,全自動生化分析儀測定血脂,包括甘油三酯(triglyceride,TC)、總膽固醇(totalcholesterol,TG)、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)。取心臟及升主動脈,對主動脈根部進行病理切片,行HE染色,使用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對粥樣斑塊進行面積測量。1.4資料處理及統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,計量資料采用單因素方差分析,采用LSD法及HSD法等進行多重比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測STZ高劑量組在注射STZ后1天即出現(xiàn)了多飲多食的癥狀,STZ小劑量組在末次注射后3天出現(xiàn)多飲多食。STZ小劑量組在末次注射后1周出現(xiàn)多尿,而高脂組一直未出現(xiàn)明顯的多尿。成模后小鼠毛色較對照組和高脂組差。STZ低劑量組在注射后7周部分出現(xiàn)血尿、少尿、全身水腫的癥狀。2.2血糖檢測結(jié)果對照組及高脂組無死亡。STZ高劑量組在注射STZ后一周內(nèi)死亡8只(死亡率67%),20天死亡11只(死亡率92%),其中有2只發(fā)生了高血糖(25.6和33.3mmol/L),4只發(fā)生了低血糖(1.8、1.6、1.3及2.8mmol/L),其余5只發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)死亡,未能檢測血糖;最后一只在注射STZ后57天死亡。STZ小劑量組共死亡6只(總體死亡率37.5%),1只在注射期間發(fā)生低血糖死亡,3只在末次注射后10天內(nèi)出現(xiàn)高血糖死亡,2只在注射后第7周出現(xiàn)血尿、少尿、水腫等癥狀后死亡(圖1)。2.3小鼠總體血糖情況由于STZ高劑量組注射后小鼠大量死亡,未列入統(tǒng)計。STZ低劑量組從第10天起,大部分小鼠出現(xiàn)明顯的高血糖,從21天起,所有小鼠出現(xiàn)明顯高血糖,且一直穩(wěn)定在較高水平。高脂組空腹血糖呈逐漸升高趨勢,到60天時達(dá)到7.78mmol/L,按照空腹血糖>7mmol/L的標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)(表1)。2.4stz對大鼠體重的影響各組基礎(chǔ)體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異;造模后1月,STZ低劑量組和高脂組體重較對照組減輕,STZ低劑量組和高脂組間無差異;造模2個月后STZ低劑量組體重較對照組和高脂組均明顯減輕,高脂組體重較對照組也明顯減輕(表2)。2.5血脂水平STZ低劑量組血脂四項指標(biāo)與對照組及高脂組相比均明顯升高,高脂組與對照組比較TC、TG、LDL均有明顯升高(表3)。3stz分次注射糖尿病制備糖尿病合并As的模型國內(nèi)外文獻(xiàn)有所提及,但并未對各種造模方法的效果、可行性進行過對比,本研究首次對以As模型鼠為基礎(chǔ)制備糖尿病模型的幾種方法進行了比較。大劑量STZ單次腹腔注射制備糖尿病合并As的文獻(xiàn)較少,文獻(xiàn)中提到有兩種方法:一是單次注射200mg/kg,二是100~125mg/kg連續(xù)兩天注射。為了避免第二次注射前的空腹8~12h可能出現(xiàn)的低血糖死亡,本研究采用了單次注射200mg/kg的方法。小鼠在1周內(nèi)死亡92%,其中有的發(fā)生低血糖、有的發(fā)生高血糖,這在注射STZ后該如何喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)了困難。一般認(rèn)為注射STZ后由于胰島的大量破壞,導(dǎo)致血清胰島素猛增,小鼠易出現(xiàn)低血糖,所以需要喂以糖水,但實驗中我們發(fā)現(xiàn)有的小鼠是出現(xiàn)了對高血糖的不耐受而死亡的,如果所有小鼠均喂以糖水,有可能會導(dǎo)致一些小鼠更容易出現(xiàn)高血糖而死亡。針對出現(xiàn)低糖和高糖的小鼠而給予的治療措施(對于低血糖者給予糖水灌胃、糖水腹腔注射,對于高血糖者給予鹽水、胰島素皮下/腹腔注射)在STZ高劑量組均未收到效果,考慮可能存在兩點原因:一是大劑量STZ對小鼠打擊過大;二是小鼠體型較小,相對大鼠而言不易施救。從死亡的情況看,大劑量單次注射的方法不易用于糖尿病合并As模型的建立。2.6糖尿病合并as的安全性判斷各組小鼠主動脈根部均出現(xiàn)明顯的粥樣斑塊。對照組與高脂組間斑塊面積大小無統(tǒng)計學(xué)差別。STZ低劑量組斑塊面積明顯增多(表4和圖2)。小劑量多次STZ腹腔注射制備的模型小鼠其血糖升高明顯且穩(wěn)定,從末次腹腔注射第10天,血糖明顯升高,且在整個實驗中維持在較高水平。死亡主要發(fā)生在兩個階段:一是造模期間,死亡主要為低血糖和高血糖;二是成模后7周,死亡原因考慮為糖尿病腎病、腎衰。因為想了解造模后的自然病理生理變化,在整個實驗期間,我們對小鼠的血糖沒有任何的干預(yù),任其升高,這增加了小鼠出現(xiàn)高滲昏迷、酮癥酸中毒、糖尿病腎病等嚴(yán)重的并發(fā)癥而出現(xiàn)死亡的概率。所以,我們認(rèn)為37.5%的死亡率是可以接受的?？紤]到ApoE－/－小鼠是基因敲除鼠,而且世代居住在SPF級的環(huán)境中,其生存能力相對于野生型小鼠會有明顯下降,這可能是該組小鼠死亡率高于用STZ制備單純糖尿病模型死亡率的原因［7，8］。高脂組血糖呈緩慢升高趨勢,本研究中一直到60天才出現(xiàn)符合糖尿病標(biāo)準(zhǔn)的空腹血糖(>7mmol/L),與文獻(xiàn)［7］報道有一定差異。該研究中血糖升高不顯著,周期長,但方法簡便、安全。有學(xué)者指出,高糖飲食干預(yù)的ApoE－/－小鼠符合代謝綜合征的表現(xiàn)而不會出現(xiàn)高血糖,高脂喂養(yǎng)的ApoE－/－小鼠則符合2型糖尿病的表現(xiàn)［7］。我們在之前的預(yù)實驗中,小劑量STZ連續(xù)腹腔注射后喂以高糖高脂飲食(豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%),小鼠全部死亡,考慮原因為高糖飲食增加了小鼠因高糖而死亡的風(fēng)險。ApoE－/－小鼠作為As模型,本身就會發(fā)生高脂血癥和動脈粥樣斑塊。本研究中高脂組血脂和斑塊面積與對照組無顯著差異,而STZ低劑量組血脂顯著升高,斑塊面積也顯著增加,是糖尿病合并As的理想模型。糖尿病建模成功并無統(tǒng)一的血糖標(biāo)準(zhǔn),有以空腹血糖>7mmol/L［4，5］,有以空腹血糖≥13.5mmol/L［10］,有以隨機血糖>11.1mmol/L［11］,有以隨機血糖>16.7mmol/L［12］。本研究采用的是空腹血糖>7mmol/L的標(biāo)準(zhǔn),而事實上,STZ低劑量組在注射STZ10天后,小鼠空腹血糖均>11.1mmol/L,且穩(wěn)定地處于較高水平。根據(jù)STZ小劑量組的數(shù)據(jù)推測,如果適當(dāng)減少STZ小劑量組每日注射劑量,可能會在保證模型成功的前提下減少死亡率,