肉雞屠宰前沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

肉雞屠宰前沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

沙門氏菌是一種常見(jiàn)的人類疾病。這種菌廣泛分布于自然界，主要寄生在動(dòng)物和昆蟲(chóng)身上。發(fā)現(xiàn)了2500多種血清素。目前,沙門氏菌中毒事件已呈全球分布,據(jù)資料統(tǒng)計(jì),在我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中,有70%~80%由沙門氏菌引起,而在引起沙門氏菌中毒的食品中,約90%是肉、蛋、奶等畜禽產(chǎn)品。雞肉是我國(guó)主要的動(dòng)物性食品之一,肉雞在養(yǎng)殖過(guò)程中容易受到沙門氏菌感染,且在其屠宰加工過(guò)程中,存在著交叉污染情況,不同環(huán)節(jié)都容易造成沙門氏菌的污染、傳播,因此,實(shí)時(shí)檢測(cè)肉雞屠宰加工過(guò)程不同環(huán)節(jié)中沙門氏菌的污染分布情況,對(duì)確保雞肉安全和食品安全有重要意義?？股氐臑E用造成大量耐藥菌株的出現(xiàn),相關(guān)數(shù)據(jù)表明,沙門氏菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率隨著時(shí)間的推移,呈上升趨勢(shì),且其耐藥性能通過(guò)食物鏈傳播到人群,對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重的危害。目前,對(duì)肉雞屠宰加工過(guò)程中不同環(huán)節(jié)沙門氏菌的污染分布研究較少。采用GB4789.4—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》方法檢驗(yàn)沙門氏菌操作繁瑣、耗時(shí)耗力,靈敏度差,PCR方法因其快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定中,尤其是多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)在食源性致病菌的檢驗(yàn)和鑒定上已得到較好應(yīng)用。目前,在沙門氏菌的PCR檢測(cè)中最常用的靶基因?yàn)閕nvA基因和hut基因。本研究通過(guò)對(duì)四川某重點(diǎn)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)和肉雞屠宰加工廠不同加工環(huán)節(jié)中沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定,了解沙門氏菌在不同加工環(huán)節(jié)中的污染分布及耐藥情況,為獸醫(yī)臨床用藥提供數(shù)據(jù)參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1肉樣的采集自四川省某重點(diǎn)肉雞養(yǎng)殖、屠宰場(chǎng)采集屠宰前肉雞糞樣、屠宰加工不同環(huán)節(jié)的胴體表面樣品(沖洗水)、分割雞肉樣以及冷凍雞肉樣,低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。1.1.2蘑菇腸炎沙門氏菌CICC21482、大腸桿菌ATCC25922四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.3細(xì)菌、菌株和引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]針對(duì)沙門氏菌的invA基因和hut基因,設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,細(xì)菌16SrDNA的PCR擴(kuò)增采用通用引物(表1),由大連寶生物工程有限公司合成。1.1.4培養(yǎng)基和培養(yǎng)基四硫磺酸鈉煌綠增菌液(tetrathionatebrothbase,TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸(selenitecystine,SC)增菌液、膽硫乳(deoxycholatehydrogensulfidelactose,DHL)瓊脂、三鐵糖瓊脂、賴氨酸脫羧酶肉湯管、營(yíng)養(yǎng)肉湯、緩沖蛋白胨水(bufferedpeptonewater,BPW)、(Mueller-Hinton)MH瓊脂青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;沙門氏菌顯色培養(yǎng)基法國(guó)科瑪嘉公司。1.1.5應(yīng)試劑及網(wǎng)絡(luò)原料DL2000DNAMarker、PCR反應(yīng)試劑、GoldviewTM核酸染料寶生物工程(大連)有限公司;BioWest瓊脂糖美國(guó)Bio-Rad公司;其余試劑為分析純或生化試劑。1.1.6氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類青霉素類:氨芐西林(ampicillin,AMP,10μg/片)、阿莫西林/克拉維酸(amoxicillin/clavulanicacid,AMC,20/10μg/片);頭孢類:頭孢曲松(ceftriaxone,CRO,30μg/片);氨基糖苷類:慶大霉素(gentamicin,GEN,10μg/片)、大觀霉素(spectinomycin,SPE,100μg/片);四環(huán)素類:四環(huán)素(tetracycline,TET,30μg/片);氯霉素類:氟苯尼考(florfenicol,FLO,75μg/片);磺胺類:甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(trimethoprim/sulfamethoxazole,SXT,1.25/23.75μg/片);喹諾酮類:萘啶酸(nalidixicacid,NAL,30μg/片)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP,5μg/片);以上試劑均購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)(北京)有限公司。1.1.7恒科技有限公司BSC-1300ⅡA2型生物安全柜蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;SORVALL離心機(jī)美國(guó)科俊儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)美國(guó)Millipore公司;C1000ThermalCyclerPCR儀、PowerPacBasic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司。1.2方法1.2.1樣品采集沿肉雞屠宰加工不同環(huán)節(jié)分別取樣。肉雞屠宰加工流程及采樣點(diǎn)見(jiàn)圖1。所有樣品均低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,待檢。1.2.2不同濃度的ctp擴(kuò)增液對(duì)豬肉的增菌劑無(wú)菌條件下,將蘸有糞樣的棉簽放置于3mL無(wú)菌生理鹽水中,浸提15min,取浸提液0.2mL加入3mL無(wú)菌TTB和SC增菌液中混勻,分別在42℃(TTB)和37℃(SC)條件下增菌培養(yǎng)24h;取雞肉25g加入225mL無(wú)菌緩沖蛋白胨水,浸提15min,4℃、10000r/min離心10min,沉淀用1mL無(wú)菌生理鹽水溶解后,取0.2mL用于增菌;污水樣經(jīng)4℃、10000r/min離心10min,沉淀用1mL無(wú)菌生理鹽水溶解后,取0.2mL用于增菌,方法同前。1.2.3沙門氏菌的分離取增菌培養(yǎng)液5μL劃線接種于DHL瓊脂平板,挑取典型菌落劃線沙門氏菌顯色平板,進(jìn)行純化,篩選出疑似沙門氏菌。1.2.4風(fēng)險(xiǎn)檢驗(yàn)按照GB4789.4—2010方法,對(duì)分離出的疑似沙門氏菌進(jìn)行三鐵糖瓊脂培養(yǎng)和賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn),并按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疑似沙門氏菌的判讀。1.2.5沙門氏菌分離的雙重pcr試驗(yàn)1.2.5.1.提取細(xì)菌總dna采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA。1.2.5.pcr擴(kuò)增hut基因疑似沙門氏菌二重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:反應(yīng)總體積為25.0μL,兩對(duì)引物濃度比例為c(invA)∶c(hut)=1∶3,其中10×PCRBuffer2.5μL,MgCl2(25mmol/L)1.5μL,dNTP2μL,invA基因上下游引物各0.5μL,hut基因上下游引物各1.5μL,DNA2.0μL,ddH2O13.0μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min,94℃變性40s,60℃退火40s,72℃延伸50s,40個(gè)循環(huán),72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖(0.5×TBE)凝膠電泳后,觀察并成像。16SrDNA的PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系(50μL)為上、下游引物各2μL(10μmol/L),模板DNA2μL,10×PCRBuffer(Mg2+Free)5μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,dNTP4μL,TaqTM(2.5U/μL)1μL,ddH2O31μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min;94℃,45s,56℃,45s,72℃,1.5min,循環(huán)30次;72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后送華大基因(上海)測(cè)序部進(jìn)行序列測(cè)定。1.2.5.pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)取腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC21482、大腸桿菌ATCC25922的DNA,同時(shí)設(shè)計(jì)不加模版、只加單側(cè)引物兩組對(duì)照,進(jìn)行二重PCR引物特異性實(shí)驗(yàn)。1.2.5.pcr擴(kuò)增片段的分析對(duì)腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC21482invA和hut基因擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收后由華大基因公司克隆測(cè)序,并進(jìn)行序列分析。同時(shí),隨機(jī)挑取二重PCR鑒定的沙門氏菌陽(yáng)性菌株進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增,其擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后送華大基因公司克隆測(cè)序。1.2.6污染率計(jì)算經(jīng)上述分離鑒定出沙門氏菌的樣品為陽(yáng)性樣品,從每一份陽(yáng)性樣品中獲得并保存一株沙門氏菌菌株。1.2.7沙門氏菌分離株的檢測(cè)采用臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散法,對(duì)沙門氏菌分離株進(jìn)行10種臨床常用抗菌藥物的抑菌直徑測(cè)定,以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株,按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和結(jié)果判斷。2結(jié)果與分析2.1連接沙門氏菌的分離培養(yǎng)根據(jù)菌落形態(tài)從DHL平板和科瑪嘉顯色平板上挑取疑似沙門氏菌,通過(guò)三鐵糖瓊脂穿刺培養(yǎng)和賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從1350份樣品中分離篩選得到疑似沙門氏菌陽(yáng)性樣品160份。2.2引物的擴(kuò)增效果對(duì)所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證,結(jié)果如圖2所示,腸炎沙門氏菌CICC21482能擴(kuò)增出2條目的片段,其余對(duì)照均未擴(kuò)增出片段,說(shuō)明所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物特異性可靠。2.3inva基因序列及同源性分析以腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC21482的DNA為模板,擴(kuò)增invA和hut基因單一基因產(chǎn)物序列分析表明,invA和hut基因PCR產(chǎn)物純化后克隆測(cè)序分別得到長(zhǎng)約為284、495bp的片斷,與設(shè)計(jì)大小相符,測(cè)得序列已在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)注冊(cè),登錄號(hào)分別為KF547932、KF547931;采用BLAST和DNASTARMegAlign進(jìn)行基因比對(duì)分析。invA(KF547932)與沙門氏菌登錄號(hào)EU348368.1、DQ644627.1等的invA基因序列有99.3%的同源性;hut(KF547931)與沙門氏菌登錄號(hào)V01372.1、V013723.1等的invA基因序列有99.2%的同源性;進(jìn)一步表明該方法正確和特異。2.4沙門氏菌陽(yáng)性菌株的篩選160株疑似沙門氏菌的二重PCR產(chǎn)物的部分電泳結(jié)果如圖3所示。156株菌均同時(shí)擴(kuò)增出284bp和495bp的特異性片段,判斷為沙門氏菌陽(yáng)性菌株。由此得出,所采集的樣品有156份為沙門氏菌陽(yáng)性。2.51沙門氏菌同源性分析結(jié)果隨機(jī)挑取兩株二重PCR鑒定為沙門氏菌的陽(yáng)性菌株,進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后得到長(zhǎng)約1465bp的片段,通過(guò)NCBI上的BLAST程序和DNASTAR的MegAlign軟件進(jìn)行比對(duì)分析,得出該兩株菌的同源性達(dá)到100%,且其與登錄號(hào)為FJ465088.1、EU118105.1的腸炎沙門氏菌同源性均達(dá)到99.0%~99.6%,由此可見(jiàn),該兩株菌均為腸炎沙門氏菌,進(jìn)一步表明invA和hut基因的二重PCR方法鑒定沙門氏菌結(jié)果準(zhǔn)確。2.6雞肉中沙門氏菌的污染由圖4可知,屠宰前(即養(yǎng)殖場(chǎng))肉雞沙門氏菌污染率為13.53%(82/606)。肉雞經(jīng)燙毛脫毛處理后,肉雞表面的沙門氏菌檢出率為0;經(jīng)開(kāi)肛處理后,肉雞表面沙門氏菌的污染率為7.23%(12/166),可能是在開(kāi)肛過(guò)程中,部分腸道內(nèi)容物的溢出,污染雞肉表面所致;取出內(nèi)臟后,雞肉表面及其胴體沖洗水中,沙門氏菌的污染率分別為9.80%(10/102)和11.54%(69/78),其污染率較之前環(huán)節(jié)上升,其原因是在于取出內(nèi)臟環(huán)節(jié),腸道內(nèi)容物可能溢出,污染雞肉表面。雞肉分割鏈條中,沙門氏菌的污染率為14.5%(29/200),經(jīng)冷凍處理后,雞肉中沙門氏菌的污染率為9.33%(14/150)。肉雞屠宰加工過(guò)程中沙門氏菌的污染率呈現(xiàn)先下降后上升,再下降的趨勢(shì)。2.7抗菌藥物耐藥結(jié)果根據(jù)CLSI(2010)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判讀,統(tǒng)計(jì)出耐藥和中介耐藥沙門氏菌菌株數(shù),并計(jì)算沙門氏菌分離株對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率。本研究中156株沙門氏菌分離株對(duì)10種抗菌藥物(組合)的耐藥率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖5。由圖5可知,沙門氏菌分離株對(duì)萘啶酸和氨芐西林的耐藥率最高,分別為100.00%、85.90%,對(duì)SXT(44.23%)、GEN(39.10%)、TET(35.26%)、SPE(21.79%)的耐藥率較高;對(duì)FLO(19.23%)、CIP(14.10%)和AMC(6.41%)的耐藥率較低,但對(duì)AMC的中介耐藥較高,為32.69%,對(duì)CRO耐藥率低,僅為1.92%。多重耐藥率(耐3種藥物及以上)為51.28%。2.8雞馬立克氏體菌的耐藥譜肉雞屠宰加工過(guò)程中分離的156株沙門氏菌對(duì)10種抗菌藥物(組合)產(chǎn)生了39種耐藥譜耐藥譜,NAL、AMP優(yōu)勢(shì)明顯,為85.90%(134/156);屠宰前(養(yǎng)殖場(chǎng))肉雞沙門氏菌分離株對(duì)10種抗菌藥物(組合)產(chǎn)生了24種耐藥譜,肉雞屠宰環(huán)節(jié)(脫毛、掏膛、沖洗)沙門氏菌分離株對(duì)10種抗菌藥物(組合)產(chǎn)生了12種耐藥譜,分割及冷凍雞肉中沙門氏菌分離株對(duì)10種抗菌藥物(組合)產(chǎn)生了20種耐藥譜,在肉雞屠宰加工過(guò)程中,從上游屠宰前(養(yǎng)殖場(chǎng))肉雞,到下游屠宰加工后的雞肉成品,沙門氏菌分離株的耐藥譜有先變窄后上升的趨勢(shì),其原因可能是由于在雞肉的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中,從養(yǎng)殖到屠宰環(huán)節(jié),再到雞肉成品,沙門氏菌的污染率先下降再上升有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,所有受試沙門氏菌,共發(fā)現(xiàn)156株對(duì)10種抗菌藥物(組合)產(chǎn)生不同程度的多重耐藥性,耐3~5種藥物的46株(29.49%),耐6~9種藥物的38株(24.36%),其中耐6、7種藥物的均為15株(9.62%),有3株(1.92%)沙門氏菌對(duì)9種抗菌藥物具有耐藥性,不同環(huán)節(jié)菌株對(duì)抗菌藥物(組合)的多重耐藥情況見(jiàn)圖6。3沙門氏菌污染率的變化invA和hut基因常用于沙門氏菌的二重PCR鑒定中,克服了針對(duì)某單一基因設(shè)計(jì)的引物其靈敏度和特異性難以滿足現(xiàn)階段的檢測(cè)要求,Cocolin、陳曉玲等利用invA和hut基因設(shè)計(jì)單一引物分別擴(kuò)增出大小為284bp和495bp的片段,邵碧英等建立了invA和hut基因的多重PCR檢測(cè)方法,其檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用此方法,并進(jìn)一步采用16SrDNA序列分析,結(jié)果說(shuō)明invA和hut基因的兩對(duì)引物準(zhǔn)確可靠。本研究將傳統(tǒng)的平板分離和PCR技術(shù)相結(jié)合,分析了肉雞屠宰加工不同環(huán)節(jié)中沙門氏菌的污染和耐藥情況,獲得了較為全面系統(tǒng)的數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),肉雞屠宰加工不同環(huán)節(jié)中沙門氏菌的污染率差異明顯。在屠宰前(養(yǎng)殖場(chǎng))肉雞的糞樣中沙門氏菌污染率較高,為13.53%,與張秀麗等的報(bào)道較為相近,高于侯小剛的報(bào)道;從養(yǎng)殖場(chǎng)到屠宰加工的各個(gè)環(huán)節(jié),沙門氏菌污染率呈現(xiàn)先下降后上升、再下降的趨勢(shì),尤其在冷凍保存后,沙門氏菌的污染率下降,這可能是由于污染沙門氏菌菌量少的肉品在冷凍過(guò)程中,低溫使其失活所致,但污染菌量較多的肉品可能導(dǎo)致部分沙門氏菌存活,當(dāng)溫度適宜其生長(zhǎng)時(shí),其有可能進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,存在潛在風(fēng)險(xiǎn);在屠宰加工環(huán)節(jié)中,沙門氏菌的污染率在分割后的雞肉中達(dá)到最高,為14.50%,其原因可能是由于在掏取內(nèi)臟過(guò)程中,腸道內(nèi)容物溢出,雞肉表面易被糞便等污染,并且在分割的長(zhǎng)鏈條環(huán)境和人員操作下存在嚴(yán)重的交叉污染所致。石穎等的調(diào)查發(fā)現(xiàn),市場(chǎng)雞肉中沙門氏菌的污染率高達(dá)69.9%,高于本實(shí)驗(yàn)研究,說(shuō)明環(huán)境衛(wèi)生、從業(yè)人員的操作等都有可能造成肉品的污染,相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)衛(wèi)生安全管理。近年來(lái),由于疾病治療及抗生素類飼料添加劑的大量使用,使沙門氏菌耐藥性迅速傳播,且其耐藥性逐漸增強(qiáng)。本研究中沙門氏菌