南瓜多糖口服液和顆粒劑對糖尿病大鼠降糖作用的研究

南瓜多糖口服液和顆粒劑對糖尿病大鼠降糖作用的研究

0糖尿病大鼠血糖的變化糖尿?。╩）是一種由胰島素絕對或相對分泌不足引起的內部疾病，主要表現為糖、脂肪、蛋白質等代謝紊亂。臨床表現為“三分之三”。換句話說，食物、飲料和尿液的增加會增加，體重會減輕。糖尿病會導致各種并發(fā)癥，嚴重危害人類健康，發(fā)病率也在逐漸上升。糖尿病是一種終身疾病，無法治愈，需要長期治療。目前，糖尿病的臨床治療藥物主要是胰島素、丙基瓜和雙胺類藥物。這些藥物的副作用包括：例如，低血糖癥、長期使用和并發(fā)癥。因此，高效低毒藥物的開發(fā)具有很強的市場前景。南瓜為葫蘆科植物.南瓜的果實,富含多種氨基酸、蛋白質、多糖、維生素、淀粉、纖維素及微量元素等,具有較高的食用價值.南瓜具有降血糖、降血脂、防治癌癥、解毒和保肝腎等功效.南瓜多糖(pumpkinpolysaccharide,PP)是南瓜中主要的降糖活性成分.實驗表明,南瓜多糖具有較好的降糖作用.將南瓜多糖制備成有效成份穩(wěn)定、質量標準統(tǒng)一、口感好、便于服用攜帶、便于儲存的口服液和顆粒劑,為南瓜多糖的進一步開發(fā)利用提供理論依據.鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是一種DNA烷基化試劑,具有升血糖的副作用,對實驗動物的胰島β細胞有選擇性破壞作用,能誘發(fā)動物產生糖尿病.本文通過建立STZ誘導的糖尿病大鼠模型,觀察南瓜多糖口服液和顆粒劑對糖尿病大鼠血糖的影響.1材料和方法1.1試劑及試劑廠成熟南瓜(市場上購買);鏈脲佐菌素(上海華藍化學科技有限公司);鹽酸二甲雙胍腸溶片(貴州天安藥業(yè)股份有限公司).葡萄糖(分析純,天津市恒興化學試劑制造有限公司);苯酚(分析純,天津市恒興化學試劑制造有限公司);濃硫酸(分析純,沈陽經濟技術開發(fā)區(qū)試劑廠);無水乙醇(分析純,天津市富宇精細化工有限公司);甘露醇(分析純,天津市大茂化學試劑廠);可溶性淀粉(分析純,天津市博迪化工有限公司);羧甲基纖維素鈉(分析純,沈陽化學試劑廠).1.2紫外/可見分光光度計RE52CS旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);UV-2550紫外/可見分光光度計(日本島津儀器公司);FD-80真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);邁瑞B(yǎng)S-380全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司).1.3試驗對象動物SD大鼠,雄性,體重170～200g,由沈陽市沈河區(qū)龍元經濟動物養(yǎng)殖場提供,合格證號:SCXK(遼)2010-0001.1.4實驗方法1.4.1南瓜多糖的制備將成熟的南瓜洗凈,去表皮、籽、瓤后切成薄片.烘干粉碎后,加入3倍量的水,熱水浸提兩次,每次4h,過濾,合并濾液,將濾液濃縮至約原體積的1/3,加95%乙醇醇沉,低溫過夜,離心得到沉淀,少量水復溶,加95%乙醇進行第二次醇沉,離心,冷凍干燥得到疏松多孔略帶淡黃色的固體,即為南瓜多糖.1.4.2苯酚-硫酸法多糖含量的測定采用苯酚-硫酸(phenol-sulfuricacid)法.此法簡單、顯色穩(wěn)定、靈敏度高、重現性好.因此應用苯酚-硫酸法測定南瓜多糖含量具有一定的參考價值.1.4.2.標準曲線的繪制精密稱取烘干(105℃)至恒重的無水葡萄糖100mg于100mL容量瓶中,加水至刻度,分別精密量取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL于10mL容量瓶中,加水至刻度,各取2mL加入6%苯酚1.0mL及濃H2SO45.0mL,振蕩搖勻,沸水浴中加熱15min,冷卻至室溫后于490nm波長處測吸光度A,以2.0mL的水按同樣顯色操作為空白,以對照品溶液濃度為橫坐標X,吸光度測定值為縱坐標Y,做標準曲線,得標準曲線方程為Y=0.012X+0.0684,r=0.9996,在10～50μg/mL范圍內線性關系良好.1.4.2.2.方法研究(1)方法的精密度精密配制高、中、低三種濃度的樣品溶液,按標準曲線項下方法操作測定吸光度,重復5次,計算日內、日間精密度均小于3%,表明本方法精密度良好.(2)重復試驗精密配制已知濃度的樣品溶液6份,按標準曲線項下方法操作測定吸光度,計算相對標準偏差為1.409%,表明本方法重復性較好.(3)方法的穩(wěn)定性測定精密配制已知濃度的樣品溶液,按標準曲線項下方法操作測定其吸光度,每隔30min測1次吸光度,一共測定6次,計算相對標準偏差為0.815%.表明樣品溶液在3h內穩(wěn)定.1.4.2.南瓜多糖含量測定精密稱取南瓜多糖200mg置于100mL容量瓶中,加入20mL水超聲溶解,然后加入80mL無水乙醇醇沉,超聲1h,冷卻至室溫后過濾,殘渣用80%乙醇洗滌2～3次,用少量沸水將濾渣洗入原容量瓶,加水定容到100mL.從上述溶液中精密量取2mL溶液定容至50mL,作為供試液.精密量取供試液2mL,按1.4.2.1方法操作,并按標準曲線計算南瓜多糖含量.測得的多糖含量為50%～60%.1.4.3南瓜多糖口服液口服液制備:羧甲基纖維素鈉在熱水和冷水中溶解度均較好,安全可靠,可作為食品的穩(wěn)定劑、增稠劑.加入適量的羧甲基纖維素鈉可明顯提高南瓜多糖口服液的穩(wěn)定性.精確稱取羧甲基纖維素鈉4g,加少量蒸餾水.待其自然膨脹溶解后,與南瓜多糖40g、山梨酸鉀2g混合,加蒸餾水超聲溶解,最后補水至1000mL,攪拌混勻,玻璃瓶灌裝,高溫滅菌,冷卻即得南瓜多糖口服液.顆粒劑制備:南瓜多糖粘度大、吸濕性強,制粒困難,所以考慮加入填充劑.甘露醇溶解性好、抗?jié)裥院玫蓧盒圆?、價格稍貴;可溶性淀粉價格低廉、性質穩(wěn)定但溶解度差.綜合考慮采用混合輔料以便取長補短,共同做為填充劑,制備多糖顆粒劑.將南瓜多糖、甘露醇、可溶性淀粉研磨成細粉,過100目篩備用.精確稱取南瓜多糖30g,甘露醇40g,可溶性淀粉30g,充分混勻,75%乙醇制軟材,20目制粒,60℃干燥1h,整粒,篩除細粉,即得南瓜多糖顆粒.1.4.4山羊口服和緊縮劑的主要物質指標的測定1.4.4.1.測定腹瀉主要品質指標的方法(1)南瓜多糖口服液中多糖含量的測定精密量取口服液10mL,溶于10mL蒸餾水中,超聲溶解30min,過濾,作為儲備液.精密量取儲備液1mL置于10mL離心管中,加入5mL無水乙醇,搖勻,靜置5min,4000r/min離心10min,傾去上層液體,沉淀用蒸餾水溶解并定容至50mL容量瓶中,作為供試液.精確吸取2mL供試液,按1.4.2.1方法操作,按照標準曲線計算南瓜多糖口服液中多糖的含量.GB47892-2010;大腸菌群的測定:GB47893-2010;致病菌的測定:SN/T1869-2007.1.4.4.2.粒劑主要物質指標的測定(1)南瓜多糖份粒劑中多糖含量的測定精確稱取南瓜多糖顆粒500mg,溶于50mL蒸餾水中,超聲溶解30min,過濾,作為儲備液.精密量取儲備液1mL置于10mL離心管中,加入5mL無水乙醇,搖勻,靜置5min,4000r/min離心10min,傾去上層液體,沉淀用蒸餾水溶解并定容至50mL容量瓶中,作為供試液.精確吸取2mL供試液,按1.4.2.1方法操作,按照標準曲線計算南瓜多糖顆粒劑中多糖的含量.(2)溶解試驗稱取顆粒10g,加熱水200mL,攪拌5min后觀察顆粒溶解情況.(3)充填顆粒篩稱取顆粒10g置于藥篩內過篩,過篩時,保持水平狀態(tài)過篩,左右往返邊篩動邊輕叩3min,不能通過1號篩(10目)和能通過5號篩(80目)的顆粒不得超過總顆粒質量的15%.(4)灰化過程中顆?？偦业臏y定稱取顆粒3g,置熾灼至恒重的坩堝中,稱定重量,緩緩熾熱,至完全炭化時,逐漸升高溫度至500℃～600℃,使完全灰化并至恒重.根據殘渣重量,計算顆粒的總灰分.(5)含水量%的測定稱取顆粒2g置于干燥至恒重的稱量瓶中,厚度不超過5mm,精密稱定,打開瓶蓋在105℃干燥5h,將瓶蓋蓋好,移置干燥器中,冷卻30min,精密稱定,再在上述溫度干燥1h,冷卻,稱重,至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止,兩次干燥稱重的差值與初始顆粒的重量比即為含水量.根據減失的重量,計算供試品中含水量(%),不得超過6%.1.4.5杏仁糖的降糖實驗1.4.5.大鼠血糖等情況的模型建立大鼠適應性喂養(yǎng)1w后,禁食24h(禁食不禁水),連續(xù)兩天腹腔注射鏈脲佐菌素55mg/kg.注射后2h喂以6%的糖水,72h后測空腹血糖值.把血糖值大于11.0mmol/L大鼠定為糖尿病大鼠.將50只糖尿病大鼠按血糖值隨機分為5組,每組10只,分別為:模型對照組,陽性對照組,南瓜多糖組,南瓜多糖口服液組,南瓜多糖顆粒劑組.模型對照組給予等體積的生理鹽水,陽性對照組給予二甲雙胍(劑量為280mg/kg),給藥組分別給予南瓜多糖、南瓜多糖口服液,南瓜多糖顆粒劑(劑量為280mg/kg).造模成功后1w灌胃給藥.每組灌胃給藥21d,一日兩次,每次2mL.每2d稱體重一次,及時調整灌胃劑量.1.4.5.2、試驗指標分別于第11、21d,給藥后7h測定血糖值.每日觀察動物體重、進食、飲水、尿量、皮毛等情況.1.4.5.3-血糖法采用眼眶取血,37℃恒溫放置30min,4000r/min離心20min,取上層血清,采用全自動生化分析儀測定血糖值.1.4.5.4-統(tǒng)計方法采用PASWStatistics18.0統(tǒng)計軟件進行T檢驗.各組數據以(x±s)表示.P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.2結果與分析2.1口服的主要物質指標2.1.1感覺指標色澤:淡黃色,均勻一致;氣味:具有南瓜特有的芳香;滋味:入口微甜,無異味;組織狀態(tài):半透明,無雜質.2.1.2物理和化學指標南瓜多糖含量≥32.20mg/mL;pH值5.0～6.0;重金屬含量及農藥殘留均符合國家衛(wèi)生標準.2.1.3微生物指數細菌總數≤100CFU/mL;大腸菌群≤40CFU/mL;致病菌:不得檢出.2.2顆粒、灰、顆粒、白砂糖的含量測定,提出南瓜多糖顆粒劑中南瓜多糖的含量:18.79%.溶化性試驗:隨著攪拌,顆粒逐漸崩解.溶解時間1min左右,最終得到澄清透明的淡黃色溶液.粒度試驗:不能通過1號篩(10目)和能通過5號篩(80目)的顆粒質量為0.873g,占總顆粒重的8.73%,符合要求.灰分測定試驗:最終得到殘渣質量為0.096g,顆粒的總灰分為3.2%,符合要求.水分測定試驗:兩次干燥稱重的差值為0.048g,含水量為2.4%,符合要求.2.33.實行《決定》第5款第5款第5.55.實行《決定》第5款第5.5.5.5.5.5.5.5%逐步形成給藥21d后,模型對照組的血糖仍處于較高的水平.給藥后與給藥前相比血糖下降明顯(P<0.05);給藥組中,南瓜多糖組、口服液組和顆粒劑組降糖率分別為43.53%、44.97%和46.20%.南瓜多糖組與制劑組相比無顯著差異.實驗表明,輔料對南瓜多糖的降糖作用影響較小.南瓜多糖、南瓜多糖口服液和南瓜多糖顆粒劑對糖尿病大鼠具有降糖作用.結果見表1.2.4糖尿病體征糖尿病大鼠一般表現為多飲、多食、多尿、體重下降、體毛松散無光澤.給藥21d后,給藥組精神逐漸好轉,進食、飲水、尿量均減少、體重較造模初期有所上升.而模型對照組的糖尿病體征沒有明顯好轉.3南瓜多糖降糖作用概述南瓜資源豐富且價廉,具有極高的營養(yǎng)價值.南瓜多糖具有明顯的降糖作用.因此,具有良好的發(fā)展前景.然而,目前進行的研究大多是南瓜多糖的活性研究,已上市的南瓜產品多是南瓜粉、南瓜籽、南瓜汁等粗加工類保健食品,南瓜多糖劑型的研究相對較少,更沒有上市的劑型.本文將南瓜中的降糖活性成分南瓜多糖提取出來并將其制成單一成分的口服液與顆粒劑,具有口感好、無不良氣味、易于服用、攜帶方便、質量穩(wěn)定、毒副作用小等優(yōu)點,提高了患者的依從性.藥理實驗結果表明南瓜多糖口服液和顆粒劑對STZ糖尿病大鼠具有明顯的降糖作用,為南瓜多糖的進一步臨床應用提供指導,并為預防及治療糖尿病提供了可靠的途徑.STZ是一種常用的誘導糖尿病模型的藥物.其易見光分解,因此需避光操作.pH為4.2～4.5時,STZ活性最好.本文所用檸檬酸緩沖液pH值為4.31.為了提高造模成功率,本文采取多次小劑量腹腔注射STZ的方法,最終可形成穩(wěn)定持久的糖尿病.多次小劑量注射STZ與一次性大劑量注射STZ相比,不僅可以提高造模成功率,還可以明顯地降低實驗動物的死亡率.在分離血清的過程中,比較容易出現溶血現象.溶血對血液標本的