乳酸桿菌lacobacalus程序開(kāi)發(fā)中的分離純化研究

乳酸桿菌lacobacalus程序開(kāi)發(fā)中的分離純化研究

由于多種抗生素的廣泛應(yīng)用，一方面會(huì)增加耐菌性植物，藥物因素會(huì)迅速傳播，另一方面會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂和腸道功能失衡。對(duì)于那些由抗生素引起的頑癥和毒副作用,臨床醫(yī)學(xué)界主張采用生物防治方法,即以菌治菌,調(diào)整腸道微生態(tài)環(huán)境,重新建立起腸道正常菌群的平衡,保證機(jī)體正常的生理功能,達(dá)到預(yù)防和治療的目的。大量的研究表明一些乳酸菌活菌制劑具有抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖、調(diào)節(jié)腸道菌群等益生作用。L.caseiZhang是一株分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬乳中的乳桿菌,研究證實(shí)具有耐酸、耐膽鹽、降膽固醇及免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)從L.caseiZhang對(duì)小鼠腸道內(nèi)的E.coliO157和K88的拮抗作用和對(duì)腸道菌群的影響進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1致病性藥品及藥物L(fēng).caseiZhang由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存;致病性E.coliO157購(gòu)自中國(guó)生物藥品鑒定所;致病性E.coliK88購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院獸醫(yī)研究所。premixTaq酶購(gòu)自寶生物(大連)有限公司。1.2模式1.企業(yè)brng菌液將昆明系小白鼠隨機(jī)分為6組,每組18只,自由采食,自由飲水。對(duì)照組1和2不灌服L.caseiZhang菌液;A、B、C和D灌服L.caseiZhang菌液(活菌數(shù)為2×108cfumL),劑量為每天10mLkg·bw,各組的劑量隨體重增加而增加灌服量,每日次,連續(xù)灌服15d。1.3iii157的測(cè)定連續(xù)飼喂L.caseiZhang15d后,對(duì)照組1以及A、B組灌服E.coliO157,劑量為0.6mL只;對(duì)照2組及C、D組灌服E.coliK88,劑量為0.6mL只,并且A、C組停止灌服L.caseiZhang菌液,B、D組繼續(xù)灌服L.caseiZhang菌液,連續(xù)5天觀察并記錄各組小鼠的發(fā)病情況。1.4腸球菌的選擇性計(jì)數(shù)宰殺A、C組停止灌服乳酸菌液第4d的及對(duì)照組未發(fā)病的小鼠,每組3只,取腸道內(nèi)容物用選擇性培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌和乳酸菌計(jì)數(shù)。1.5pcr擴(kuò)增根據(jù)VersalovicJ等報(bào)道的ERIC-PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,上游引物序列ERIC1R:5′-ATGTAAGCTCCTGGGATTCAC-3′;下游引物序列ERIC2:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。采用CTAB法提取從各組分離純化的大腸桿菌和乳酸菌單個(gè)菌落的基因組總DNA,稀釋后作為PCR擴(kuò)增的模板,采用25μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增:premixTaq12.5μL,引物1.5μL(各25pmol)、基因組模板2μL(約100ng),DEPC水9μL。PCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性7min;90℃變性30s,52℃退火1min,65℃延伸8min,35個(gè)循環(huán)后65℃延伸16min。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1小鼠的死亡情況連續(xù)飼喂L.caseiZhang15d后對(duì)照組1及A、B組用E.coliO157攻擊,對(duì)照2組及C、D組用E.coliK88攻擊,以及B、D組繼續(xù)連續(xù)灌服L.caseiZhang活菌液5d后,各組小鼠的死亡情況見(jiàn)表1。由表1結(jié)果可知,未灌服L.caseiZhang的小鼠用E.coliO157攻毒后在5d內(nèi)共死亡12只,死亡率為66.67%,A、B組5d內(nèi)的死亡率分別為16.67%和5.56%,說(shuō)明灌服L.caseiZhang可以大大降低因E.coliO157攻毒造成的小鼠死亡率,特別是攻毒后繼續(xù)灌服L.caseiZhang可以進(jìn)一步降低小鼠的死亡率。同樣,灌服L.caseiZhang也可以降低由E.coliK88引起的小鼠死亡率,雖然其效果表面上看起來(lái)不像E.coliO157攻毒那樣明顯,這主要可能是E.coliK88菌株對(duì)小鼠的致死性不及E.coliO157強(qiáng)。2.2乳酸菌和大腸桿菌的選擇性從連續(xù)飼喂L.caseiZhang15d和攻毒后停止灌服乳酸菌液第4d小鼠的腸道內(nèi)容物中用選擇性培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌和乳酸菌進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)(每組3只),見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),在攻毒后停止飼喂乳酸菌的第4天從小鼠腸道內(nèi)仍分離到L.caseiZhang且數(shù)量很高,而且喂L.caseiZhang使小鼠腸道中大腸桿菌總數(shù)極顯著低于對(duì)照組。2.3同一菌的晶體結(jié)構(gòu)一般同種細(xì)菌的rDNA區(qū)域高度保守,用ERIC-PCR可以反映腸道內(nèi)大腸桿菌、乳酸桿菌不同菌株間的多樣性。以分離到的大腸桿菌和乳酸桿菌菌株以及和標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜顯示大多數(shù)分離菌株間的ERIC-PCR圖譜有差異,表明ERIC-PCR分析可以揭示非常豐富的個(gè)體水平上的多樣性。根據(jù)分離株間圖譜的異同來(lái)判斷是否為同一株菌。從A、C組分離的乳酸桿菌以及L.caseiZhang的ERIC-PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖1,將圖1結(jié)果用NTSYS2.1軟件聚類(lèi)分析見(jiàn)圖2,以相似性系數(shù)0.8為界可以將從A、C組分離的乳酸桿菌分為6類(lèi),由圖2可知菌10與已知菌1(L.caseiZhang)為同一株菌,所以10為L(zhǎng).caseiZhang;7和9為同一株菌;4、5、6、8、13、14、15為未知的同一株菌,11與12為同一菌株。對(duì)攻毒后的第4d從對(duì)照組分離的大腸桿菌以及標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coliO157和k88進(jìn)行ERIC-PCR電泳見(jiàn)圖3,將圖3結(jié)果用NTSYS2.1軟件聚類(lèi)分析見(jiàn)圖4,由圖4可以看出1和2為同一株菌,均為E.coliO157;3和14為同一株菌,均為E.coliK88,這表明在攻毒后的第4d從對(duì)照組分離到了E.coliO157和k88。對(duì)連續(xù)灌服乳酸菌的B、D組分離的大腸桿菌進(jìn)行ERIC-PCR電泳見(jiàn)圖5,由圖5可以看出7和8為同一株菌,更重要的是沒(méi)有分離到E.coliO157和K88,這說(shuō)明E.coliO157和K88由于乳桿菌對(duì)其抑制從而使致病菌的數(shù)量下降。3對(duì)致病菌的保護(hù)作用乳酸桿菌在預(yù)防腸道疾病及治療腹瀉方面有著重要意義。乳酸桿菌通過(guò)磷壁酸與腸粘膜上皮細(xì)胞形成一個(gè)生理屏障,提高定殖阻力,對(duì)致病菌和條件致病菌的