豬腸道擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬熒光定量檢測(cè)方法的建立

豬腸道擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬熒光定量檢測(cè)方法的建立

-擬桿菌屬的假列沃菌屬是假桿菌科的兩個(gè)屬。新梢菌屬以多個(gè)假桿菌為中心，不產(chǎn)生氨基酸，但產(chǎn)生氨基酸的口腔式假菌菌被歸類為purovoliplant菌屬。Ley等的研究發(fā)現(xiàn)肥胖鼠盲腸內(nèi)容物或肥胖人的糞便的擬桿菌門數(shù)量低于瘦鼠或瘦人,Backhed等對(duì)無(wú)菌鼠接種單一多形擬桿菌時(shí),卻發(fā)現(xiàn)無(wú)菌鼠的體脂肪顯著增加,造成差異原因可能是擬桿菌門或單一的擬桿菌對(duì)肥胖反應(yīng)的情況不一樣。脂肪型豬和瘦肉型豬的情況又如何,能否通過(guò)這些研究對(duì)豬脂肪沉積的調(diào)控提供一些線索,都有必要進(jìn)行研究。豬后腸道中擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬在擬桿菌門中所占比例為66%,其中擬桿菌屬占17%,普雷沃氏菌屬占49%。考慮到引物可將特異性的種屬擴(kuò)增出來(lái),并可將其定量,因此可選用主要的種屬作為擬桿菌門的代表來(lái)分析擬桿菌門的差異。本文以擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬作為豬腸道擬桿菌群的代表分析其在長(zhǎng)白豬和太湖豬上的差異。本文建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群的方法,并對(duì)5月齡長(zhǎng)白和太湖豬回腸內(nèi)容物的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群進(jìn)行了定量檢測(cè)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1pcr擴(kuò)增及測(cè)序熒光定量PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad,iCycleriQ),核酸蛋白檢測(cè)儀(BeckmanCoulter,DU800),常規(guī)PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad,Tetrad2),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,VersaDocModel2000),硅膠模型TMPCR產(chǎn)物純化試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司),DL2000DNAMarker(北京天為時(shí)代技術(shù)有限公司),熒光定量PCR試劑盒(TaKaRaEXTaqR-PCRVersion2.1)。1.1.2中間普雷沃菌tki多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron,CDC1404-A)和中間普雷沃菌(Prevotellaintermedia,ATCC25261)購(gòu)自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院,以BHI瓊脂培養(yǎng)基(OXOID,英國(guó))培養(yǎng);大腸桿菌、兩雙歧桿菌及乳酸桿菌參考菌株來(lái)自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床教研室,采用通瓊脂培養(yǎng)基(含葡萄糖)。1.1.3豬回腸干草種制備挑選剛出生的體重相近的長(zhǎng)白和太湖豬各30頭,在相同環(huán)境條件下以相同日糧配方(無(wú)抗生素)飼喂,在年齡達(dá)到5月齡時(shí),兩品種豬各屠宰4頭,采集回腸內(nèi)容物并測(cè)定體脂。1.2方法1.2.1從腸道內(nèi)容物和細(xì)菌中提取物質(zhì)取菌液1mL,回腸內(nèi)容物0.1g,采用酚-氯仿法抽提DNA模板,所有樣品模板最終定容于30μL的TE中,-70℃保存?zhèn)溆谩?.2.2常規(guī)pcr檢測(cè)參照Lisa等報(bào)道,依據(jù)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬內(nèi)種的16SrDNA基因序列設(shè)計(jì)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬特異引物,上游引物為5′-GATTAGATACCCTGGTAGTCC-3′和下游引物為5′-CATGCAGCACCTTCACAA-3′,擴(kuò)增片段大小268bp,以回腸內(nèi)容物的DNA為模板做常規(guī)PCR,并對(duì)產(chǎn)物測(cè)序。1.2.3熒光定量pcr根據(jù)1.2.2測(cè)定的片段序列結(jié)果,應(yīng)用軟件PrimerExpress2.0設(shè)計(jì)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬的熒光定量PCR引物與特異探針,通過(guò)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的正確性。參照TaKaRaEXTaqR-PCRVersion2.1熒光定量PCR說(shuō)明書(shū),采用25μL體系,其中加5×RealTimePCRBuffer(Mg2+)5μL,dNTPMixture(各10mol/L)0.75μL,上下游引物混合物(10mol/L)0.5μL,TaKaRaExTaqHS(5U/μL)0.25μL,模板1μL,加水至25μL;采用2步法,反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,60℃退火、延伸、采集熒光30s,設(shè)置50個(gè)循環(huán)。分別對(duì)反應(yīng)體系中Mg2+工作濃度和探針工作濃度進(jìn)行優(yōu)化。1.2.4od620值的檢測(cè)以多形擬桿菌菌株(CDC1404-A)DNA為模板,用常規(guī)PCR引物擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收純化后的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品,用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)OD260值,其拷貝數(shù)=50(μg/mL)×10-3×OD×N(阿佛加德羅常數(shù):6.02×1023分子/摩爾)/660(堿基對(duì)平均分子量)×268(擴(kuò)增堿基數(shù))。以標(biāo)準(zhǔn)品為模板,以10倍梯度稀釋,取不少于5個(gè)稀釋梯度作為模板,按上述體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),構(gòu)建絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr敏感性檢測(cè)取1μL抽提的多形擬桿菌菌液基因組,10倍梯度稀釋作為模板并設(shè)陰性對(duì)照分析敏感性,按上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性。以乳酸桿菌、大腸桿菌和雙歧桿菌的基因組DNA模板作陰性細(xì)菌對(duì)照,以多形擬桿菌和和中間普雷沃菌的基因組為模板作為陽(yáng)性對(duì)照,以去離子水作無(wú)模板對(duì)照,驗(yàn)證擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬探針特異性。1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)將待測(cè)樣品DNA抽提液按與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陰性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品校正,每個(gè)樣品都做3個(gè)平行復(fù)孔,以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性。1.2.7豬背157段的脂肪率測(cè)定背膘厚度的測(cè)定:測(cè)量5月齡豬的左半胴體6~7肋骨處、肩部最后處、胸腰結(jié)合處和腰薦接合處的背膘厚度,4點(diǎn)平均值為豬的背膘厚度。脂肪率的測(cè)定:將左半胴體進(jìn)行分割,分為骨骼、皮膚、瘦肉和脂肪組織。脂肪率=脂肪重/(瘦肉重+脂肪重+骨骼重+皮膚重)×100%。2結(jié)果2.1srrna的基因片段用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)常規(guī)PCR產(chǎn)物,結(jié)果擴(kuò)增出長(zhǎng)度為268bp特異性條帶見(jiàn)圖1。該P(yáng)CR產(chǎn)物純化后(見(jiàn)圖1),測(cè)定的序列(上?；瞪锛夹g(shù)有限公司)結(jié)果如下:GATTAGATACCCTGGTAGTCCGCGCGGTAAACGATGGATGCTCGCTGTCAGCGATATACCGTTGGTGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGCATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAATTGCA此序列長(zhǎng)為212bp,與GenBank中發(fā)表的多形擬桿菌(基因序列號(hào)為M58763)和中間普雷沃菌(基因序列號(hào)為AY323522)16SrDNA基因序列相比,該片段為多形擬桿菌的792—1003和中間普雷沃菌(基因序列號(hào)為AF414822)的763—974位堿基的片段,同源性分別為92%和94%。2.2反應(yīng)片段大小根據(jù)2.1測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)熒光定量的上下游引物分別為5′-GGTGGCCAAGCGAAAGC-3′和5′-AGGAACATGTGGTTTAATTCGATG-3′,探針FAM-TACGCCGGCAACGGTGAAACTCA-TAMRA,擴(kuò)增片段大小115bp。當(dāng)Mg2+終濃度為5.0μmol/L、探針終濃度為0.24μmol/L時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng),曲線斜率最大,PCR擴(kuò)增效率最高。2.3考核出設(shè)備中copoes/l的發(fā)作濃度268bpPCR產(chǎn)物純化后經(jīng)電泳檢測(cè)呈清晰條帶,不含非特異性擴(kuò)增帶(圖1),這保證了絕對(duì)定量的準(zhǔn)確性。純化的PCR產(chǎn)物的OD260值為0.0673,計(jì)算出拷貝數(shù)濃度為1.19×1010copies/μL。采用1.19×102~1.19×106copies/μL這5個(gè)稀釋梯度進(jìn)行定量PCR反應(yīng),由軟件IQTM5Opticalsystemversion1.0構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),此標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.200X+42.262(Y代表Ct,X代表logcop),相關(guān)系數(shù)為0.999,PCR循環(huán)效率為105.4%。2.4熒光定量pcr的靈敏度檢測(cè)多形擬桿菌菌液個(gè)數(shù)1.12×109個(gè)/mL,基因組定容于30μL的TE中,即3.73×107個(gè)/μL基因組,取1μL10倍梯度稀釋(3.73×10-1~3.73×106個(gè)/μL)作模板,檢測(cè)熒光定量PCR的靈敏性,如圖3示,從曲線可知道3.73個(gè)細(xì)菌仍有特征性曲線生長(zhǎng),說(shuō)明該實(shí)時(shí)熒光定量具有較高的敏感性。2.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢測(cè)特異性TaqMan探針除了能夠特異性檢測(cè)擬桿菌和普雷沃氏菌外,對(duì)乳酸桿菌、大腸桿菌、雙歧桿菌及無(wú)模板對(duì)照組無(wú)熒光信號(hào)放出(圖4)。2.6實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果以每克內(nèi)容物為檢測(cè)單位,被檢測(cè)單位所提取的基因組最終定溶于30μL的TE中。FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.200X+42.262(Y代表Ct,X代表logcop),根據(jù)其線性范圍1.19×102~1.19×106copy/μL,確定1μL模板檢測(cè)的logcop范圍2.08~6.08,則30μL定容模板的logcopy檢測(cè)結(jié)果在3.55~6.35范圍內(nèi)。每份樣品所含拷貝數(shù)都可通過(guò)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀直接給出定量結(jié)果(表1)。結(jié)果每克回腸內(nèi)容物擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬數(shù)量的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值,長(zhǎng)白豬為4.05±0.24,太湖豬為5.61±0.66,太湖豬比長(zhǎng)白豬高38.5%(P<0.10)。由表1可知,5月齡太湖豬的背膘厚度和脂肪率與長(zhǎng)白豬的差異達(dá)到了顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。2.7普雷沃氏菌群與脂肪率的關(guān)系對(duì)各頭豬的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群數(shù)量與相應(yīng)的背膘厚度、脂肪率進(jìn)行線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群數(shù)量與背膘厚度之間(r=0.83,P<0.05)及與脂肪率之間(r=0.71,P=0.11)有正相關(guān)關(guān)系。3討論3.1ssr熒光定量檢測(cè)由于16SrD-NA屬內(nèi)及屬間高度的同源性,加大了擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬特異性引物的設(shè)計(jì)難度。本文在GenBank中下載豬擬桿菌屬內(nèi)12種細(xì)菌和普雷沃氏菌屬內(nèi)18種細(xì)菌的16SrDNA序列,應(yīng)用CLUSTALX同源性比較軟件進(jìn)行同源性比較,其同源段再與豬腸道其他3種優(yōu)勢(shì)菌(大腸桿菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌)屬間序列比較,篩選出擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬特異序列,根據(jù)此片段設(shè)計(jì)了一對(duì)常規(guī)引物,對(duì)該引物擴(kuò)增片段測(cè)定序列后,根據(jù)測(cè)定的序列設(shè)計(jì)了熒光定量特異引物。探針的特異性檢測(cè)表明,該探針只能與本菌屬的代表菌株特異性結(jié)合并釋放出熒光,而與腸道中其他優(yōu)勢(shì)菌屬的代表菌株呈陰性反應(yīng),表明所設(shè)計(jì)的探針具有良好特異性;在探針的敏感性方面,TaqMan探針敏感性為3.73個(gè)/μL。3.2標(biāo)準(zhǔn)品的驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)是以多形擬桿菌(CDC1404-A)的DNA作為模板,用常規(guī)引物做PCR,將此PCR產(chǎn)物回收純化后作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品。2.3的結(jié)果表明,制備的標(biāo)準(zhǔn)品正確,回收產(chǎn)物均達(dá)到了1010copies/μL的拷貝濃度,表明具有良好的回收效率。由定量標(biāo)準(zhǔn)曲線可見(jiàn),擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線其初始模板濃度與Ct值之間呈較好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)均為0.999,PCR擴(kuò)增效率為105.4%,連續(xù)濃度梯度之間Ct值之差在3.30左右,符合10倍梯度稀釋的熒光曲線規(guī)律。3.3肥度和肉中擬桿菌數(shù)量本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)長(zhǎng)白和太湖豬回腸內(nèi)容物中的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果均成陽(yáng)性,說(shuō)明此技術(shù)對(duì)豬腸道內(nèi)擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬進(jìn)行定量分析是可行的。本研究發(fā)現(xiàn)太湖豬回腸內(nèi)容物擬桿菌屬數(shù)量高于長(zhǎng)白豬,隨著背膘厚度和脂肪率的增加,擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬群細(xì)菌數(shù)量呈增加趨勢(shì),這一結(jié)果與劉祥等在人的研究結(jié)果一致,他發(fā)現(xiàn)肥胖人的糞便中擬桿菌屬數(shù)量(傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定)顯著高于瘦人。但與Ley等的結(jié)果不一致。分析其原因,其一,擬桿菌門、屬或單一的擬桿菌種與肥度相關(guān)性可能不一致;其二,不同腸段(回腸和盲腸)擬桿菌數(shù)量與胴體肥度的相關(guān)性可能不相同;其三,豬腸道擬桿菌組成不同于人和鼠,豬后腸擬桿菌主要由