益生菌對嬰幼兒期感染性疾病患兒抗生素應用中腹瀉的預防作用及腸道菌群的變化

益生菌對嬰幼兒期感染性疾病患兒抗生素應用中腹瀉的預防作用及腸道菌群的變化

感染疾病是兒科最常見的疾病，抗生素廣泛應用于兒童。幾乎所有的抗生素均可誘發(fā)腹瀉,其發(fā)生率約為5%～25%。嬰幼兒由于其腸道菌群仍處于動態(tài)平衡的建立階段,腹瀉的發(fā)生率更高。作者從腸道菌群變化的角度,了解抗生素應用過程中腸道菌群的改變,并探討益生菌對抗生素相關性腹瀉的預防作用。1對象和方法1.1入院時用藥物方案均為兒科醫(yī)院2003年12月～2004年5月診治的支氣管炎和肺炎患兒,共89例,男51例,女38例。年齡1月～2歲。其中肺炎58例,支氣管炎31例,均符合兒科學診斷標準。入院時均無腹瀉等胃腸道疾病,無慢性疾病,非危重病例,起病前未使用過抗生素,隨機分成兩組。治療組44例,男女之比為1.4∶1,平均年齡(8.1±4.4)月,使用抗生素分別為:青霉素類17例,頭孢類24例,其他4例。對照組45例,男女之比為1.3∶1,平均年齡(7.4±3.8)月。使用抗生素分別為:青霉素類18例,頭孢類23例,其他3例。1.2方法1.2.1藥物治療和并發(fā)癥益生菌組自開始使用抗生素起加服雙歧桿菌三聯(lián)活菌(長雙歧桿菌、嗜熱乳桿菌、糞鏈球菌各107CFU),每天2次。對照組只使用抗生素而不用任何微生態(tài)制劑。兩組支氣管炎和肺炎治療情況(抗生素應用和對癥治療)基本相同。觀察每日大便的次數(shù)及形狀,腹瀉定義為1d內(nèi)至少連續(xù)2次以上水樣便。出現(xiàn)腹瀉后兩組均加用思密達治療。1.2.2腸道菌群的檢測分別在抗生素給藥前及給藥后第3、6d采集患兒糞便,用熒光定量PCR的方法檢測腸道菌群的變化。腹瀉患兒均送大便常規(guī)、細菌培養(yǎng)(志賀菌、致病性大腸桿菌、沙門菌、弧菌)和輪狀病毒檢測。1.2.3細菌pcr擴增與分析①標本處理:參照RFWang等人的方法,取新鮮大便(1～4h)1g加9mlPBS(0.05M,pH7.4),充分振蕩混勻5～10min,然后低速離心(200×g)5min,取上清液,重復3次,高速離心(9000×g)3min,沉淀的細菌用PBS液洗4次,水洗1次。加0.1ml蒸餾水懸浮,以1%TritonX-100破碎菌體,DNA煮沸5min,立即放入冰水中冷卻備用。②PCR引物設計:利用PrimerPremier5引物設計軟件,在各細菌屬16SrRNA序列特異性區(qū)域設計上下游引物見表1。③熒光定量PCR:50μl反應體系包括:10×Buffer5μl,4×dNTP(10mM)1μl,上下游引物各1μl,模板5μl,Taq酶0.5μl,熒光染料SYBRgreenI1μl,水35.5μl。采用ABI7000型實時熒光PCR儀(美國生物應用公司產(chǎn)品)進行擴增與分析,94℃變性3min后,各細菌循環(huán)參數(shù):雙歧桿菌94℃×20秒,60℃×1min;乳酸桿菌94℃×20秒,58℃×20秒,72℃×30秒;大腸桿菌94℃×20秒,55℃×25秒,72℃×30秒,40個循環(huán)。取準確定量的細菌DNA(雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌)做系列稀釋后同時進行PCR反應,作為標準曲線。2結果2.1益生菌組與對照組患兒中患腹瀉發(fā)生率比較益生菌組44例患兒中發(fā)生腹瀉5例(發(fā)生率為11.3%),對照組45例患兒中患腹瀉21例(發(fā)生率為46.6%),益生菌組患兒腹瀉發(fā)生率顯著低于對照組(χ2=11.755,P<0.05)。2.2常規(guī)、培養(yǎng)及輪狀病毒檢測d益生菌組腹瀉患兒的腹瀉平均病程(1.30±0.24)d,大便常規(guī)、培養(yǎng)及輪狀病毒檢測均陰性。對照組患兒腹瀉平均病程(2.10±0.33)d,2例大便常規(guī)見白細胞,但少于10個,大便培養(yǎng)均陰性,輪狀病毒檢測1例陽性。2.3兩組桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量比較抗生素治療過程中,腸道菌群出現(xiàn)明顯改變,未用益生菌對照組糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌較抗生素治療前顯著減少(P<0.01),而益生菌組抗生素治療后雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量較穩(wěn)定,明顯高于對照組(P<0.01)。在抗生素治療后3d和6d,對照組患兒糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌均較益生菌組顯著減少(P<0.01)。見表2。3討論3.1益生菌與制劑腹瀉在兒科感染性疾病的治療中經(jīng)常發(fā)生,我們的研究表明應用益生菌使抗生素相關性腹瀉的發(fā)生率由對照組的46.6%降至11.3%,且腹瀉程度亦較對照組輕,在使用抗生素的過程中同時服用雙歧桿菌三聯(lián)制劑能有效預防抗生素相關性腹瀉。JAVanderhoof等報道乳酸桿菌(LGG)可預防兒童抗生素相關性腹瀉。2002年ALDsouza等收集了1966～2000年有關益生菌預防抗生素相關性腹瀉的38篇文獻,并對其中9篇符合隨機雙盲隨機對照的臨床研究進行了Meta-分析,比較了益生菌與安慰劑對腹瀉的預防作用。在這些研究中,4項研究使用boulardii酵母菌,5項為乳酸桿菌,結果顯示益生菌能預防和治療抗生素相關性腹瀉。并認為在使用抗生素的過程中同時服用益生菌能有效預防抗生素相關性腹瀉。分析還提示益生菌可減少癥狀,縮短患者住院天數(shù),減少住院費用。3.2益生菌對藥物作用的影響大多數(shù)益生菌預防抗生素相關性腹瀉,都僅限于臨床癥狀的觀察,關于抗生素對腸道菌群的動態(tài)影響以及益生菌對其的作用鮮見報道。我們觀察了抗生素應用中腸道菌群的變化以及添加益生菌后腸道菌群的變化。發(fā)現(xiàn)抗生素應用3d腸道菌群即有明顯變化,雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌均明顯減少,而添加益生菌組腸道菌群無明顯變化,說明益生菌可以減少抗生素治療對腸道菌群的干擾,并減少腹瀉的發(fā)生率。3.3抗生素的影響抗生素相關性腹瀉的發(fā)病機理與腸道菌群失調有關,目前認為主要是腸道益生菌減少一方面使碳水化合物不能酵解成乳酸和短鏈脂肪酸,初級膽汁酸不能生成次級膽汁酸,積滯在腸道而導致滲透性腹瀉;另一方面生理性菌群的減少和消失減低了其對致病菌的抑制,少數(shù)菌種如葡萄球菌、變形桿菌、綠膿桿菌、念珠菌、大腸桿菌等大量繁殖,產(chǎn)生氨類及內(nèi)毒素,而致腹瀉。其次有的抗生素能引起腸道粘膜的變態(tài)反應或對粘膜有直接毒性作用。還有的抗生素如紅霉素有促進胃腸排空作用,克拉維酸能刺激腸蠕動等均可導致腹瀉。益生菌防治抗生素相關性腹瀉的作用機制,目前認為