嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)基配方優(yōu)化及培養(yǎng)條件研究

嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)基配方優(yōu)化及培養(yǎng)條件研究

細(xì)菌素是一種抑制細(xì)菌代謝過(guò)程中對(duì)某些基因和親水關(guān)系附近的細(xì)菌。它可以抑制或殺死一些食品腐敗的細(xì)菌，具有一定的穩(wěn)定性，容易被人體胃腸道的一些酶分解，因此它不會(huì)引起副作用。細(xì)菌素不僅種類(lèi)豐富,而且在自然界的存在十分普遍,幾乎每種細(xì)菌均可產(chǎn)細(xì)菌素。截至目前己發(fā)現(xiàn)的乳酸菌細(xì)菌素有40余種,分別是由乳球菌、片球菌、明串珠菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、肉食桿菌等屬的菌株產(chǎn)生的。細(xì)菌素被廣泛用于食品添加劑和飼料添加劑。隨著抗生素耐藥性問(wèn)題的加劇,細(xì)菌素將在人類(lèi)疾病防治、動(dòng)物醫(yī)藥保健及食品防腐等方面體現(xiàn)巨大的應(yīng)用潛力。細(xì)菌素與抗生素的根本差別是抗生素的抑菌譜較廣,往往有毒副作用,而細(xì)菌素只對(duì)近緣關(guān)系的菌起作用,具有無(wú)毒、無(wú)副作用、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性,同時(shí)也不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn);抗生素會(huì)引起耐藥性,因此,細(xì)菌素可以在部分情況下減少甚至取代抗生素的使用。本試驗(yàn)采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件,從而提高了細(xì)菌素的產(chǎn)量。1材料和方法1.1試劑:蛋白牛肉膏,蛋白牛肉膏,白砂糖,碳酸鈣等嗜酸乳桿菌來(lái)源于大連工業(yè)大學(xué)資源開(kāi)發(fā)利用研究所。指示菌株為大腸桿菌。試劑:葡萄糖,蛋白胨,牛肉膏,氯化鈉,碳酸鈣,瓊脂粉,吐溫-80,MgSO4·7H2O,檸檬酸三銨,K2HPO4·3H2O,MnSO4·H2O,均為國(guó)產(chǎn)生化試劑和分析純。1.2設(shè)備和設(shè)備721型可見(jiàn)分光光度計(jì),JA2003N電子天平,冷凍離心機(jī),培養(yǎng)箱,搖床,精密pH計(jì)。1.3培養(yǎng)基的制備牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,水1000mL,調(diào)pH7.0~7.2。嗜酸乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g,蛋白胨5g,牛肉膏4g,氯化鈉3g,碳酸鈣1g,加水至1000mL,自然pH值。固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂。種子液培養(yǎng)基:麥芽汁25mL,蛋白胨5g,牛肉膏4g,氯化鈉3g,碳酸鈣1g,加水至1000mL,自然pH值。1.3測(cè)試方法1.3.1菌種制備嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液的制備:將嗜酸乳桿菌種子液以2%的接種量接種到嗜酸乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中,經(jīng)30℃發(fā)酵24h后,將發(fā)酵液在4℃、10000r/min離心15min,取上清液,放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ甘揪旱闹苽?用接菌環(huán)挑取指示菌接種于5mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30℃過(guò)夜培養(yǎng)。1.3.2愛(ài)酸乳菌的濃度計(jì)算機(jī)平板稀釋計(jì)數(shù)法:將菌體發(fā)酵液進(jìn)行10倍梯度稀釋,選擇合適的濃度涂布于嗜酸乳桿菌固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。1.3.3發(fā)酵抑菌圈測(cè)定打孔法:將指示菌液100μL均勻涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,用打孔器在培養(yǎng)基上打孔,用鑷子挖出孔中的瓊脂塊,將嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液滴入孔中,靜置30min,放入30℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后,觀察抑菌圈大小,記錄抑菌圈直徑。細(xì)菌素效價(jià)的測(cè)定:按照丁成為的方法測(cè)定細(xì)菌素的相對(duì)效價(jià),做出細(xì)菌素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線,指示菌為大腸桿菌。2結(jié)果與討論2.1產(chǎn)細(xì)菌素的最佳培養(yǎng)條件2.1.1細(xì)菌素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線以細(xì)菌素效價(jià)值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),抑菌圈直徑為橫坐標(biāo),做細(xì)菌素效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=1.0288x+0.1025,y表示細(xì)菌素效價(jià)的對(duì)數(shù)值,x表示抑菌圈直徑,R2=0.9967。2.1.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)嗜酸乳桿菌細(xì)菌素穩(wěn)定性的影響以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)不同時(shí)間后,測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖2)表明,當(dāng)嗜酸乳桿菌培養(yǎng)4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在4h~10h嗜酸乳桿菌增長(zhǎng)較快,10h~16h進(jìn)入穩(wěn)定期,之后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。在菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),細(xì)菌素開(kāi)始產(chǎn)生,并且隨著時(shí)間的增加,細(xì)菌素的產(chǎn)量也在不斷提高,當(dāng)培養(yǎng)到22h時(shí)細(xì)菌素的效價(jià)值最高,此后,細(xì)菌素的產(chǎn)量不斷地下降。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因:一是細(xì)菌素發(fā)生了分解而失活;二是部分細(xì)菌素吸附在菌體細(xì)胞表面,使得細(xì)菌素活性下降,所以培養(yǎng)時(shí)間選擇22h。2.1.3接種量對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià)的影響分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)22h,測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖3)表明,當(dāng)接種量為3%時(shí)菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià)均達(dá)到最大值,因此最佳接種量為3%。2.1.4種子液培養(yǎng)時(shí)間將培養(yǎng)不同時(shí)間的種子液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)22h,測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖4)表明,當(dāng)種子液培養(yǎng)14h時(shí)菌體濃度達(dá)到最大,但是在16h時(shí)雖然菌體濃度有所下降,但是細(xì)菌素的效價(jià)最高,因此為了得到更高的細(xì)菌素,種齡的最佳培養(yǎng)時(shí)間選擇16h。2.1.5發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph值對(duì)菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià)的影響將種子液培養(yǎng)16h后,按3%的接種量接種于不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)22h,測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖5)表明,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.6時(shí),菌體濃度與細(xì)菌素效價(jià)均到達(dá)最大值,因此選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.6。2.1.6培養(yǎng)溫度對(duì)菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià)的影響將嗜酸乳桿菌在上述最佳條件下接種后,分別在不同溫度培養(yǎng)22h,測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖6)表明,當(dāng)在37℃培養(yǎng)時(shí),菌體濃度與細(xì)菌素效價(jià)均達(dá)到最大值,因此選擇培養(yǎng)溫度為37℃。2.1.7搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià)的影響將嗜酸乳桿菌在最佳條件下接種后,在不同搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)22h,測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖7)表明,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160r/min時(shí),雖然菌體濃度有所下降,但是細(xì)菌素效價(jià)達(dá)到最大值,因此為了得到更高效價(jià)的細(xì)菌素,選擇搖床轉(zhuǎn)速為160r/min。2.2產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)基的優(yōu)化2.2.1葡萄糖添加量的確定在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L的葡萄糖,在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng),測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖8)表明,當(dāng)葡萄糖添加量為10g/L時(shí),菌體濃度與細(xì)菌素效價(jià)均達(dá)到最大值,因此發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇濃度為10g/L的葡萄糖。2.2.2復(fù)合氮源的確定選擇蛋白胨與牛肉膏為復(fù)合氮源,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10g/L的葡萄糖,總氮濃度分別為10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L,蛋白胨與牛肉膏比例為1∶1,在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng),測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖9)表明,當(dāng)總氮含量為30g/L時(shí),菌體濃度與細(xì)菌素效價(jià)均達(dá)到最大值,因此發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇30g/L的比例為1∶1的蛋白胨與牛肉膏作為復(fù)合氮源。2.2.3吐溫-80對(duì)菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià)的影響在已經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的吐溫-80,以未添加吐溫-80的培養(yǎng)基為對(duì)照,在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng),測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖10)表明,當(dāng)添加0.2mL/L的吐溫-80時(shí),菌體濃度明顯增加,而細(xì)菌素效價(jià)卻略有下降。添加吐溫-80使菌體濃度增加的原因是改變了細(xì)胞膜的通透性,但是對(duì)細(xì)菌素的活性產(chǎn)生了抑制作用,因此綜合以上2種影響,認(rèn)為不應(yīng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加吐溫-80。2.2.4培養(yǎng)基的設(shè)置(1)硫酸鎂對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響:在已經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的MgSO4·7H2O,以未添加MgSO4·7H2O的培養(yǎng)基為對(duì)照,在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng),測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖11)表明,當(dāng)添加0.4g/LMgSO4·7H2O時(shí),雖然菌體濃度沒(méi)有達(dá)到最高,但是細(xì)菌素的效價(jià)值最高,因此為了得到更高效價(jià)的細(xì)菌素,選擇在培養(yǎng)基中加入0.4g/L的MgSO4·7H2O。(2)檸檬酸三銨對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響:在已經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的檸檬酸三銨,以未添加檸檬酸三銨的培養(yǎng)基為對(duì)照,在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng),測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖12)表明,當(dāng)添加2g/L的檸檬酸三銨時(shí),細(xì)菌素的效價(jià)值最高,因此選擇在培養(yǎng)基中加入2g/L的檸檬酸三銨。(3)硫酸錳對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響:在已經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的MnSO4·H2O,以未添加MnSO4·H2O的培養(yǎng)基為對(duì)照,在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng),測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖13)表明,當(dāng)添加0.2g/L的MnSO4·H2O時(shí),細(xì)菌素的效價(jià)值最高,因此選擇在培養(yǎng)基中加入0.2g/L的MnSO4·H2O。(4)磷酸氫二鉀對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響:在已經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的K2HPO4·3H2O,以未添加K2HPO4·3H2O的培養(yǎng)基為對(duì)照,在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng),測(cè)其菌體濃度和細(xì)菌素效價(jià),結(jié)果(圖14)表明,當(dāng)添加4g/LK2HPO4·3H2O,細(xì)菌素的效價(jià)值最高,因此選擇在培養(yǎng)基中加入4g/L的K2HPO4·3H2O。2.3正交試驗(yàn)2.3.1檸檬酸三銨用量根據(jù)單因素結(jié)果,固定鹽濃度分別為氯化鈉3g/L、碳酸鈣1g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、檸檬酸三銨2g/L、K2HPO4·3H2O4g/L和MnSO4·H2O0.2g/L。將葡萄糖(A)、蛋白胨∶牛肉膏(B)、初始pH值(C)、接種量(D)作為正交試驗(yàn)的4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。2.3.2最優(yōu)發(fā)酵條件的確定正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。通過(guò)分析可見(jiàn),影響細(xì)菌素效價(jià)的主要因素是接種量,影響因素的主次順序?yàn)镈>A>C>B。通過(guò)正交試驗(yàn),得出最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B1C3D1,即接種量為2%,葡萄糖含量為10g/L,蛋白胨∶牛肉膏為1∶1,初始pH值為6.8。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見(jiàn)表3,可見(jiàn)葡萄糖濃度、蛋白胨∶牛肉膏、初始pH值、接種量這4個(gè)因素對(duì)細(xì)菌素效價(jià)的影響都不顯著。2.3.3測(cè)試測(cè)試驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,結(jié)果表明優(yōu)化后菌體濃度增加了51.05×107cfu/mL,細(xì)菌素效價(jià)為231.34AU/mL。3接種量的確定試驗(yàn)