針刀松解法對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠中樞不同部位亮氨酸-腦啡肽的影響

針刀松解法對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠中樞不同部位亮氨酸-腦啡肽的影響

近年來，針灸松樹法廣泛應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)?。╧oa）的治療，以及緩解疼痛方面的更好療效。內(nèi)源性阿片肽(endogenousopioidpeptides,EOP)是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)合成的具有阿片樣活性的肽類物質(zhì),是一類重要的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì),廣泛分布于腦和脊髓,具有鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、應(yīng)激反應(yīng)、精神活動(dòng)等作用。腦啡肽(enkephalin,ENK)是最早被發(fā)現(xiàn)的EOP,包括甲硫氨酸-腦啡肽(metenkephalin,M-ENK)和亮氨酸-腦啡肽(leuenkephalin,L-ENK),兩者結(jié)構(gòu)相似。ENK在外周及中樞的鎮(zhèn)痛作用已被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí),且可被電針刺激增強(qiáng)。以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明針刀松解法在提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耐痛閾及促進(jìn)鎮(zhèn)痛物質(zhì)釋放方面具有與電針相似的效果。本實(shí)驗(yàn)以木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的KOA大鼠為模型,系統(tǒng)觀察針刀松解法干預(yù)后中樞不同部位L-ENK的變化并與電針干預(yù)相比較,旨在進(jìn)一步研究針刀松解法在脊髓及脊髓以上水平的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物清潔級(jí)3月齡健康SD大鼠共60只,雌雄各半,體重200~230g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):SCXK京2008-0002)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表分為空白組和模型組,空白組15只,模型組45只。1.2豐隆穴穴神經(jīng)刺激儀針刀(Ⅰ型4號(hào),0.60mm×40mm,北京華夏針刀醫(yī)療器械廠);毫針(0.25mm×25mm,蘇州針灸用品有限公司);穴位神經(jīng)刺激儀(韓氏HANSLH202H,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);20%烏拉坦(天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn),批號(hào):06051121);低溫離心機(jī)(5810R,德國Eppendorf公司);超低溫冰箱(MDF-U50A,日本SANYO公司);電子天平(AE-160,瑞士METTLER公司);L-ENK放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所提供)。1.3造模、注射和模型排除模型組45只大鼠均按改良的Murat等法制備膝骨關(guān)節(jié)炎模型。具體方法為4%木瓜蛋白酶溶液與0.3mol/L半胱氨酸溶液1∶1混置0.5h,同時(shí)大鼠用20%烏拉坦按0.4ml/kg腹腔麻醉后仰臥位固定于操作臺(tái),用剃須刀片剃除大鼠左膝及其周圍絨毛,濕紗布擦洗潔凈后用碘伏消毒。術(shù)者左手使大鼠左膝微屈,右手持1ml注射器由髕骨內(nèi)側(cè)下方斜向上刺入關(guān)節(jié)腔,注入混合液20μl。造模第1、4、7天分別配制新鮮混合液并進(jìn)行注射。第7天注射后圈養(yǎng)大鼠4周。造模過程中,若出現(xiàn)足底潰爛、感染、上呼吸道感染、骨折等,均予以排除。造模過程中,因足底腫脹、顱內(nèi)高壓、意外死亡的原因排除模型大鼠3只。造模過程中用于判斷模型成功與否9只。將其余造模成功33只大鼠,按隨機(jī)數(shù)字表分為模型組11只,針刀組11只,電針組11只。1.4電針治療組空白組同期正常飼養(yǎng)。模型組造模成功后正常飼養(yǎng),無治療。電針組造模第36天開始治療,采用比較解剖學(xué)的方法,選取內(nèi)外膝眼穴,用毫針進(jìn)行針刺,與膝關(guān)節(jié)縱軸呈45°向上斜刺2~3mm,連接刺激儀,采用頻率2Hz/100Hz,電流強(qiáng)度2mA進(jìn)行電針治療,每次10min,隔日治療1次,每周3次,共治療3周。針刀組造模第36天開始治療,對(duì)患膝進(jìn)行觸診,于關(guān)節(jié)周圍特別是髕骨周圍找到條索狀物并用甲紫定點(diǎn),每次選1~2個(gè)點(diǎn),常規(guī)備皮、消毒,針刀到達(dá)病變點(diǎn)后,行縱向疏通及橫向剝離,出針后以消毒棉簽按壓針眼片刻,膠布貼封針眼。在手法放松膝關(guān)節(jié)周圍軟組織基礎(chǔ)上予以關(guān)節(jié)拔伸和被動(dòng)屈伸活動(dòng),每周1次,共3次。1.5觀測(cè)指標(biāo)和方法1.5.1一般情況下1.5.2相關(guān)部位腦質(zhì)中提取采用放免測(cè)定法測(cè)定大鼠脊髓、延髓、中腦、丘腦、海馬的L-ENK含量。造模后第57天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材,斷頭法處死動(dòng)物,迅速從枕骨大孔處開顱取出大鼠腦組織,分離出延髓、中腦、丘腦、海馬,剪開脊椎椎弓,取出腰膨大處脊髓。各部位腦組織及脊髓于冰皿上編號(hào),樣品稱重后置于-70℃保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按放免試劑盒操作說明進(jìn)行,依次加樣后混合均勻,4℃孵育24h,然后加入分離劑,混勻后于4℃靜置30min,3600r/min離心20min,去上清,測(cè)定沉淀的cpm值。以N/T、B/T計(jì)算NSB及S0結(jié)合百分率,以B/B0計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及待測(cè)樣品結(jié)合百分率,在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算結(jié)果。1.6模型組數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,空白組與模型組之間比較采用成組資料t檢驗(yàn),模型組與電針組、針刀組之間比較采用單因素方差分析。2結(jié)果2.1大鼠術(shù)后水腫造模后1~3d,模型組、針刀組、電針組大鼠關(guān)節(jié)局部腫脹,大鼠活動(dòng)量減少,個(gè)別大鼠跛行明顯,出現(xiàn)健側(cè)承重現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)后期腫脹逐漸消失,肉眼觀察與健側(cè)區(qū)別不明顯。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物飲食基本正常,毛色未見明顯改變。2.2針刀和電針干預(yù)對(duì)海馬中l(wèi)-enk含量的影響造模后,模型組大鼠L-ENK含量在脊髓、中腦、海馬較空白組高,在延髓和丘腦與空白組含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。針刀和電針干預(yù)后,針刀組海馬中L-ENK含量較模型組升高,中腦L-ENK含量較模型組降低。海馬中L-ENK含量針刀組較電針組高,其余部位差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。3針刀松解對(duì)nd-enk表達(dá)的調(diào)節(jié)針刀治療KOA有較好療效,有學(xué)者認(rèn)為本法改變了局部組織結(jié)構(gòu),有利于解除引起疼痛的刺激源,特別是機(jī)械性刺激如組織粘連、攣縮等,這種改變可減輕炎癥對(duì)末梢神經(jīng)的刺激,起到減輕疼痛的作用。EOP作為一類重要的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì),其鎮(zhèn)痛作用一直備受關(guān)注。其中對(duì)ENK的研究較為清楚的是其分布在腦內(nèi)各級(jí)水平及脊髓內(nèi)并不均勻,其中下丘腦、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、脊髓背角淺層分布較多。ENK神經(jīng)元大部分是短軸突的中間神經(jīng)元,能形成局部環(huán)路,也有些較長的ENK能投射通路,如從中縫核到脊髓背角的通路。在脊髓水平EOP可通過作用于初級(jí)傳入終末的受體使興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放減少,從而抑制興奮性突觸傳遞。在本實(shí)驗(yàn)中,模型組較空白組含量升高,而針刀組和電針組較模型組未出現(xiàn)顯著改變。腦干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)匯集了不同來源和不同性質(zhì)的各種感覺及運(yùn)動(dòng)信息,在鎮(zhèn)痛過程中起到了承上啟下的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在延髓,模型組與空白組以及模型組與針刀組、電針組的差異性并不明顯,這可能與延髓中縫核群主要為5-HT神經(jīng)元匯集處有關(guān)。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)是由不同類型細(xì)胞組成的核團(tuán),不但接受來自皮層、下丘腦、網(wǎng)狀核、藍(lán)斑的傳入,也接受來自脊髓的信息傳入,多數(shù)高級(jí)中樞的鎮(zhèn)痛效應(yīng)都可能經(jīng)過中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)中在中腦,模型組L-ENK含量較正常組升高,針刀組較模型組含量降低,而在丘腦各組均未出現(xiàn)顯著差異,針刀組中腦L-ENK含量的可能與鎮(zhèn)痛物質(zhì)的下行釋放有關(guān)。海馬是腦啡肽及其受體表達(dá)豐富的腦區(qū)之一。本實(shí)驗(yàn)中,模型組含量較正常組顯著