基因表達(dá)譜芯片在遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用

基因表達(dá)譜芯片在遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用

80%的腫瘤發(fā)生在中國(guó)，尤其是廣東省和廣東省。其發(fā)生與遺傳和環(huán)境中的多種因素有關(guān)。遺傳因素中基因改變?yōu)橹饕?包括點(diǎn)突變、擴(kuò)增、重排、缺失或甲基化狀態(tài)等,是多基因的改變,這些改變體現(xiàn)在基因是否表達(dá)和表達(dá)數(shù)量上的多少。以往由于研究手段的限制,每次僅能對(duì)個(gè)別基因研究,無法同時(shí)闡明多基因改變的結(jié)果。自1995年Stanford大學(xué)的Schena等首次報(bào)道基因表達(dá)譜芯以來,基因芯片憑借其高通量、快速檢測(cè)基因的優(yōu)點(diǎn),迅速成為研究腫瘤發(fā)病機(jī)制、早期診斷、病理特征、預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移及評(píng)估預(yù)后的全新方法。近幾年,國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者應(yīng)用芯片技術(shù)在腫瘤領(lǐng)域進(jìn)行了初步研究,取得了一些有意義的結(jié)果。本研究應(yīng)用14112點(diǎn)基因表達(dá)譜芯片技術(shù),分析比較了鼻咽癌組織與鼻咽慢性炎癥組織之間基因表達(dá)的差異,以期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織表達(dá)的特異基因。1材料和方法1.1檢測(cè)一般資料2003年6月—2004年10月,在鼻咽癌研究所收集鼻咽癌組織樣本200例,從中選取符合以下條件的樣本20例,研究組入選條件:廣西籍;病理確診為低分化鱗癌,尚未進(jìn)行放療、化療等抗癌治療者;血紅蛋白>11g/L者,抽提RNA后電泳結(jié)果符合做芯片檢測(cè)要求者。其中男18例,女2例,中位年齡50歲,按鼻咽癌92分期Ⅱ期3例,Ⅲ期12例,Ⅳ期5例,EB-VCA-IgA陽性15例,陰性5例,EA-IgA陽性10例,陰性10例,壯族9例,漢族11例。對(duì)照組15例,入選條件:廣西籍;獲知情同意志愿者;家族成員中無遺傳病及腫瘤病史;病理確診為慢性炎癥組織;EB病毒陰性。其中男11例,女4例,中位年齡45歲,壯族5例,漢族10例。入選者在鼻咽纖維鏡直視下活檢,活檢組織分2份,1份送病理檢查,1份馬上放液氮中凍存。1.2生物基因型基因表達(dá)譜基因表達(dá)譜芯片采用上海博星基因芯片公司提供的BioStarH-141s(2004)型基因表達(dá)譜芯片,含有14112點(diǎn)的人類全長(zhǎng)基因cDNA表達(dá)譜芯片。其中包括陽性對(duì)照96點(diǎn),陰性對(duì)照16點(diǎn),內(nèi)參基因20點(diǎn),空白對(duì)照41點(diǎn)。1.3測(cè)試方法1.3.1酸性酚-氯-3-甲基-1-酸性酚-氯-3-基苯磺酸酯的制備碾磨凍存的組織成粉末狀。勻漿,離心。取上清液,經(jīng)1∶1的酚-氯仿抽提兩次后,在經(jīng)NaAc(PH4.5)和1∶1的酸性酚-氯仿液抽提;等體積異丙醇-20℃沉淀1.5h,12000r/min高速離心15min后,經(jīng)75%乙醇洗滌沉淀,紫外分析電泳檢測(cè)顯示,獲得高質(zhì)量的總RNA。1.3.2逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記ssedutp采用QIAGEN公司的OligotexmRNAMiniKit分離純化mRNA。每份取3.5pgmRNA,參照Schena等行逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化,在鏈合成中摻入熒光素標(biāo)記的dUTP,用Cy3-dUTP標(biāo)記鼻咽慢性炎癥組織mRNA,用Cy5-dUTP標(biāo)記鼻咽癌組織mRNA。將探針及玻片置于95℃水浴中變性,然后將探針置于芯片上,用蓋玻片覆蓋,放入42℃雜交箱內(nèi)雜交過夜(16～18h)。然后用SSC和SDS溶液洗滌10min,于室溫晾干后掃描。1.3.3掃描芯片觀察用GeneralScanning公司ScanArray4000掃描儀掃描芯片,觀察雜交結(jié)果,過濾背景噪聲。用GenePix3.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值(Ratio值),并用內(nèi)參基因?qū)Y(jié)果做歸一化處理。1.4統(tǒng)計(jì)與分析1.4.1ratio值的計(jì)算篩選差異表達(dá)的基因,標(biāo)準(zhǔn)為取Ratio值Cy5/Cy3*大于2或小于0.5,其中Cy3*為經(jīng)過芯片歸一化處理過的Cy3值。Ratio值大于2.0判斷為基因表達(dá)上調(diào),小于0.5判斷為該基因表達(dá)下調(diào)。篩選出的差異表達(dá)基因被認(rèn)為NPC發(fā)病相關(guān)基因。1.4.2基因組學(xué)功能選取了至少在8例病例中都有上調(diào)或下調(diào)的基因使用網(wǎng)上生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)軟件對(duì)差異表達(dá)的基因做功能的分析。網(wǎng)址為,使用的數(shù)據(jù)庫軟件為Onto-Express。1.4.3使用cloter和uu搜索軟件選取至少在14例病例中都發(fā)生上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因做非監(jiān)督聚類分析。2結(jié)果2.1ste20-打造kicase,jk-ste20-ste5d-sslc192在20例鼻咽癌病例中,全部發(fā)生上、下調(diào)的基因3條,核糖體蛋白S6激酶(ribosomalproteinS6kinase,RPS6KC1),STE20-類似蛋白激酶(STE20-likekinase,JIK),可溶載體家族16成員2(solutecarrierfamily16member2,SLC16A2),19例(90%)18條,14例(70%)123條,10例(50%)471條。其中很多基因在多個(gè)病例中都出現(xiàn)高度一致的表達(dá)異常,這些基因可能是和鼻咽癌的發(fā)病直接相關(guān)的基因。2.2與腫瘤相關(guān)的重要基因篩選20例中同時(shí)至少在14例(70%)病例中都有上調(diào)表達(dá)的基因27條,選取其中10條(見表1)。2.3與腫瘤相關(guān)的重要減少基因篩選在20例鼻咽癌中同時(shí)至少14例(70%)都有下調(diào)表達(dá)的基因96條,選取其中10條(見表2)。2.4基因功能群分析利用生物信息學(xué)對(duì)20例鼻咽癌中至少有8例同時(shí)發(fā)生變化的基因功能群進(jìn)行分析,涉及生理過程的基因277條,分子結(jié)構(gòu)活性(structuralmoleculeactivity)40條(見表3)。2.5非聚類分析生物統(tǒng)計(jì)采用非監(jiān)督聚類發(fā)現(xiàn)20例鼻咽癌可分成兩類,但與臨床分期無關(guān),是否與預(yù)后有關(guān)有待追蹤觀察(見圖1)。3肺癌功能基因構(gòu)建腫瘤基因表達(dá)譜,涉及基因數(shù)據(jù)龐大,常規(guī)手段及實(shí)驗(yàn)方法難以勝任?；蛐酒?chip)和微陣列(microarray)技術(shù)可同時(shí)對(duì)幾千上萬個(gè)基因進(jìn)行半定量分析,成功的解決了這一難題。DeRisi等利用cDNA微陣列簡(jiǎn)單構(gòu)建人癌基因表達(dá)譜,開創(chuàng)了腫瘤基因表達(dá)譜研究的先河。Golub等通過比較不同白血病樣本基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),將白血病區(qū)分為源于骨髓的急性白血病和源于淋巴母細(xì)胞的急性白血病兩中亞型,找到一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)特異性差異表達(dá)基因。鼻咽癌80%發(fā)生在中國(guó),所以在鼻咽癌的應(yīng)用研究報(bào)道國(guó)外的很少,主要是來自國(guó)內(nèi)湖南、廣東,而作為高發(fā)區(qū)的廣西尚未見報(bào)道。對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系的研究多于對(duì)鼻咽癌組織的研究。對(duì)鼻咽癌組織、癌旁組織和鼻咽慢性炎癥組織等進(jìn)行對(duì)比研究目前仍然不多,研究?jī)H來自3個(gè)單位70多例鼻咽癌組織標(biāo)本的40多張表達(dá)譜芯片,所用基因芯片太多包含的基因數(shù)量較少(幾百至上千之間),且多是以往研究的與癌癥有關(guān)的基因,無法反映某種特定狀態(tài)下的腫瘤基因表達(dá)的全貌;或是所用的組織樣本例數(shù)少,結(jié)果代表性差。利用網(wǎng)上生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù),我們分析了在8例病例中都有差異表達(dá)的基因的功能群(表3),我們注意到,初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織存在的大量差異表達(dá)基因涵蓋了許多不同的功能群落,涉及基因包括信號(hào)與蛋白傳遞、癌基因與原癌基因、免疫和發(fā)育相關(guān)基因、凋亡基因,以及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子,一些生物酶的酶活調(diào)節(jié)等,這和一些文獻(xiàn)中報(bào)道的基本一致,的確是多基因參與了許多不同的生物學(xué)途徑共同調(diào)節(jié)了鼻咽癌的發(fā)生和病變。在20例NPC病變組織與慢性炎癥組織之間存在大量的差異表達(dá)基因,全部都發(fā)生上、下調(diào)的基因3條,19例(90%)18條,14例(70%)123條,10例(50%)471條。至少在14例(70%)病例中都有上調(diào)表達(dá)的基因27條,下調(diào)表達(dá)的基因96條,其中目前報(bào)道與鼻咽癌有關(guān)的基因有PLNUNC、RBL2和PROL4等,分別有17例(85%),14例(70%),17例(85%)表達(dá)下調(diào)。PLUNC至少發(fā)現(xiàn)有8個(gè)家族成員,家族內(nèi)的同一基因,又有多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本,如SPLUNC1,根據(jù)其非翻譯區(qū)的不同,就有NASG、Spurt、lunx等不同的轉(zhuǎn)錄本。研究表明PLUNC基因家族集中表達(dá)在鼻咽、口腔、鼻腔、呼吸道及消化道組織,可能有抗菌、免疫的作用,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。LUNX在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào);NASG轉(zhuǎn)錄本雖然在正常鼻咽組織中表達(dá),但在鼻咽癌組織中71%表達(dá)下調(diào)或缺失,具有明顯特異性,是鼻咽癌抑癌候選基因。RBL2(P130)基因是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因家族成員之一,能與不同的病毒癌蛋白和轉(zhuǎn)錄因子E2F、細(xì)胞周期蛋白或其依賴性激酶等相互作用,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Claudio等發(fā)現(xiàn)P130基因在鼻咽癌細(xì)胞系HONE-1中有基因重排,基因表達(dá)明顯下調(diào),第19或第21外顯子突變。國(guó)內(nèi)報(bào)道鼻咽癌p130基因的表達(dá)量(46.2%)顯著低于對(duì)照組(81.8%)。PROL4基因可能對(duì)粘膜行使保護(hù)功能,如微生態(tài)的調(diào)節(jié),張必成等用RT-PCR證實(shí)PROL4基因在鼻咽癌上皮細(xì)胞株HNE1和87%(42/48)的鼻咽癌活檢標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)。另外,在表達(dá)上調(diào)的基因中RPS6KC1是第一次被發(fā)現(xiàn)和鼻咽癌相關(guān),本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)報(bào)道過這個(gè)新基因的發(fā)現(xiàn),但是功能尚未有人研究。表達(dá)下調(diào)的基因中,前列腺分泌蛋白(PSP),對(duì)前列腺和腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用。核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是一種主要存在于結(jié)締組織中與膠原纖維相關(guān)的蛋白聚糖,可以與多種細(xì)胞因子(CKS)及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子結(jié)合,對(duì)多種腫瘤的生長(zhǎng)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用,并具有抑制免疫、血管生成及細(xì)胞凋亡作用,如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、纖維肉瘤,骨肉瘤等。其他很多基因是否與腫瘤相關(guān)目前尚未見報(bào)道,如JIK、SLC16A2、LXN、B3GALT4、RPS6KC1等。利用基因聚類軟件Cluster對(duì)20例樣本和基因分別做了非監(jiān)督聚類數(shù)據(jù)分析。發(fā)現(xiàn)20