變異鏈球菌對牙面的黏附

變異鏈球菌對牙面的黏附

變異病原體是口腔中的一種重要引起的疾病。致蟲性昆蟲的主要活性因素是牙齒表面的粘附，糖含量的利用，以及強烈的酸和耐酸性。變異鏈球菌對牙面的黏附是其定植、致齲的基礎(chǔ)。變異鏈球菌與齲齒有著非常密切的聯(lián)系,明確變異鏈球菌的黏附機制有助于找到高效、方便、快捷且不良反應小的有效藥物,以便齲病的預防和治療。1黏附反應階段黏附是微生物在特定的組織表面定植的首要條件,是微生物與宿主發(fā)生關(guān)系和致病的基礎(chǔ)。其機制至今尚不完全清楚。主要的學說包括非特異性靜電學說(鈣橋作用)、氫鍵結(jié)合、疏水作用和特異性黏結(jié)素-受體學說。目前,備受關(guān)注的是黏結(jié)素-受體學說,即細菌表面的蛋白樣成分或附屬結(jié)構(gòu)作為黏結(jié)素與組織表面特異性受體結(jié)合完成黏附作用。非特異性黏附,即非蔗糖依賴性黏附,是細菌黏附的第1步。當菌體與遞質(zhì)表面接觸且間距為10~20nm時,兩者間會產(chǎn)生排斥力,菌體可利用靜電、氫鍵和疏水作用等物理化學力來克服這種排斥力;當間距小于10nm時,菌體與遞質(zhì)表面產(chǎn)生較強的引力,從而使菌體有機會進行特異性黏附。第2階段是變異鏈球菌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase,GTF)利用蔗糖合成水不溶性葡聚糖來介導該菌的蔗糖依賴性黏附和集聚。GTF和葡聚糖可能通過提供葡聚糖結(jié)合蛋白(glucanbindingprotein,GBP)的結(jié)合位點直接影響變異鏈球菌初始黏附,因此,GTF催化產(chǎn)生的葡聚糖對初始黏附也有一定的意義。2特異性黏附的調(diào)節(jié)作用口腔細菌在牙面的選擇性定居,主要是其表面黏結(jié)素與牙面受體分子以立體化學方式特異性結(jié)合的結(jié)果。黏結(jié)素通常是指細菌表面某種特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或糖脂成分,可存在于細菌細胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛和微毛等結(jié)構(gòu)中,在黏附中充當配體角色。受體則是存在于唾液中的一種能夠識別和選擇性結(jié)合特定配體的大分子物質(zhì),多為糖蛋白,一般包括與配體結(jié)合的區(qū)域和產(chǎn)生效應的區(qū)域。黏結(jié)素-受體介導的特異性黏附在細菌生物膜形成中起著決定性的作用。當受體與配體結(jié)合后,受體的構(gòu)象改變并產(chǎn)生活性,啟動一系列信號傳導過程,最終表現(xiàn)為生物學效應。目前,與黏附有關(guān)的變異鏈球菌表面成分有細菌表面蛋白,如相對分子質(zhì)量(Mr)為1.8×105的P1以及Mr為1.1×105、1.2×105、1.3×105的糖蛋白脂磷壁酸等。有報道稱:GTF可作為變異鏈球菌的表面成分參與細菌對牙面的特異黏附。2.1菌表面蛋白初級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列及濃度變異鏈球菌的表面蛋白抗原P(surfaceproteinantigenP,SpaP)含有1500~1566個氨基酸殘基,Mr為1.8~2.1×104。變異鏈球菌表面蛋白初級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列分為一個信號肽區(qū)(aa1~38),兩個保守區(qū)[A區(qū)(aa186~464)和P區(qū)(aa840~963)],一個可變區(qū)[V區(qū)(aa679~823)],一個壁跨區(qū)(aa1486~1535)和一個跨膜區(qū)(aa1536~1556)。其中A區(qū)富含丙氨酸,含有82個氨基酸殘基的重復序列,呈α-螺旋狀,屬于黏附功能區(qū),與唾液糖蛋白具有高度的親合力;P區(qū)富含脯氨酸,表現(xiàn)為高度疏水性,呈暴露狀,形成伸展狀態(tài)的β-片層結(jié)構(gòu),含有豐富的T、B淋巴細胞黏附表位,其近N端對人具有很好的免疫原性。2.1.1可溶性糖質(zhì)糖化及其功能表面蛋白P1和P1樣蛋白是變異鏈球菌主要黏結(jié)素之一,也是研究最多也是較肯定的黏結(jié)素。P1和P1樣蛋白存在于細胞表面的絨毛層中,在血清型c變異鏈球菌中被稱為P,其Mr為1.8×105,是主要的細胞表面抗原,含有兩個主要的抗原決定簇,可通過蛋白溶解釋放。P1和或P1樣蛋白參與變異鏈球菌與牙面的非蔗糖依賴黏附,對變異鏈球菌在牙面的初始黏附起重要的作用。P1既能以共價結(jié)合方式存在于細胞壁,亦可脫離細胞壁成為游離態(tài)。P1一旦游離,則細菌的黏附能力下降。低pH值、細菌的高生長率、果糖替代葡萄糖作為糖源等均可使P1游離態(tài)增多,結(jié)合態(tài)減少,導致細菌在獲得性膜上的黏附降低。P1還與變異鏈球菌的疏水性有關(guān),即它可通過立體化學識別牙面受體和疏水反應而介導細菌黏附,表面疏水性越強的細菌黏附力越強。在人類的口腔中,疏水性菌株較親水性菌株容易定居;因此,P1質(zhì)量越高的變異鏈球菌,黏附性越強。Crowley等證實,缺乏表面蛋白抗原Ⅰ、Ⅱ的變異株,對無菌鼠模型的致齲性降低。周智等發(fā)現(xiàn),隨殼寡聚糖質(zhì)量濃度的增高,變異鏈球菌的細胞表面疏水性明顯下降,即殼寡聚糖可能對變異鏈球菌表面的疏水性分子表達有抑制作用,從而降低了細菌對牙面的黏附性。在就植物提取物對變異鏈球菌的疏水性和黏附作用的影響所進行的研究中,最低抑菌質(zhì)量濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)之下(7.81~31.25mg·L-1)的意大利永久花提取物降低了細胞表面的疏水性,對變異鏈球菌黏附到玻璃表面的抑制率接近90%。1g·L-1的可可塊提取物對變異鏈球菌的疏水性有明顯的抑制作用,對變異鏈球菌MT8148R的疏水抑制率達48%。程睿波等發(fā)現(xiàn),隨著白屈菜紅堿溶液質(zhì)量濃度的升高,變異鏈球菌的表面疏水性逐漸減弱,黏附率也隨之降低。這表明白屈菜紅堿可抑制變異鏈球菌細胞表面的疏水性和黏附作用,其機制可能是白屈菜紅堿與表面蛋白間的化學反應引起表面蛋白化學結(jié)構(gòu)的變化和數(shù)量的減少,從而降低了變異鏈球菌細胞表面的疏水性,并導致黏附減少。2.1.2重復區(qū)的基因免疫A區(qū)多肽的主動免疫或被動免疫,都可以激發(fā)宿主針對變異鏈球菌的特異性細胞免疫和體液免疫應答。無論是針對完整的SpaP的特異性抗體,還是針對SpaP的唾液結(jié)合功能區(qū)的抗體,都能明顯阻礙變異鏈球菌在唾液包裹的羥磷灰石上的附著。Katz等發(fā)現(xiàn),SpaP抗體能使嚙齒類動物、靈長類動物和人的齲齒發(fā)生率明顯降低。Takahashi等在使用SpaP的A重復區(qū)合成肽免疫小鼠時發(fā)現(xiàn),變異鏈球菌在牙面的附著明顯受到抑制。Redman等發(fā)現(xiàn),表兄鏈球菌SpaP/A的抗體能保護大鼠免遭表兄鏈球菌所致的齲侵害。上述研究表明,表面蛋白抗體能有效阻斷細菌最初在牙面的黏附、聚集和定植。劉天佳等以變異鏈球菌SpaP中的T、B細胞表位和黏附功能區(qū)相關(guān)肽段的編碼基因為外源基因構(gòu)建基因防齲疫苗,免疫動物檢測到特異性表面蛋白抗原C(proteinantigenC,PAc)抗體,結(jié)果所構(gòu)建的基因疫苗具有明顯的防齲作用。賈榮等將SpaP/A區(qū)和P區(qū)同時克隆到載體質(zhì)粒中構(gòu)建防齲基因疫苗,免疫動物后可檢測到特異性抗體。這些研究證實,根據(jù)PAc分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建的多種基因工程防齲疫苗,都可激發(fā)宿主產(chǎn)生特異性細胞免疫和體液免疫應答,有效抑制變異鏈球菌在口腔中的定居與繁殖,降低齲齒的發(fā)生率。鑒于A區(qū)的分子結(jié)構(gòu)及其重要的生物學功能,曲云鵬等將SpaP的A區(qū)編碼基因克隆到可用于人體免疫的真核表達質(zhì)粒pVAX1中,經(jīng)轉(zhuǎn)染真核細胞COS-7證實,該重組質(zhì)粒能正確表達目的蛋白。以該重組質(zhì)粒免疫動物能誘導機體產(chǎn)生針對SpaP/A區(qū)的特異性抗體,阻斷變異鏈球菌對牙面的蔗糖依賴和非依賴黏附,起到防齲的作用。2.2變異鏈球菌發(fā)生蔗糖依賴在變異鏈球菌眾多的表面抗原中,GTF無疑是最重要的。GTF能使蔗糖轉(zhuǎn)化為水溶性葡聚糖(watersolubleglucan,WSG)和非水溶性葡聚糖(waterinsolubleglucan,WIG)。WSG又稱右旋糖酐,通過α-1,6糖苷鍵連接葡糖基形成葡聚糖結(jié)構(gòu),主要作為細胞外能源儲庫及底物,誘導底物依賴性GTF合成水溶性和非水溶性葡聚糖;WIG又稱變聚糖,通過α-1,3糖苷鍵將葡糖基彼此連接成葡聚糖。WIG具有黏性,在細菌黏附、菌斑形成中起著重要的作用,是變異鏈球菌致齲的主要毒力因子之一。變異鏈球菌在代謝過程中可以產(chǎn)生細胞外GTF,而GTF在變異鏈球菌的定植中起著關(guān)鍵性作用。大多數(shù)變異鏈球菌至少含有g(shù)tfB、gtfC、gtfD基因,少數(shù)還有g(shù)tfA基因。gtfB基因編碼的GTF-Ⅰ合成WIG,gtfC基因編碼的GTF-SI合成WIG和WSG的混合物,gtfD基因編碼的GTF-S合成WSG。gtfD并非變異鏈球菌蔗糖依賴性定植所必需,而gtfB和gtfC則與變異鏈球菌蔗糖依賴性黏附密切相關(guān)。gtfB和gtfC失活可使變異鏈球菌喪失在牙光滑面上實施蔗糖依賴性定植的能力。根據(jù)gtfB的核苷酸序列推測,GTF-Ⅰ氨基酸序列中不含半胱氨酸,其5’端存在多個細胞外信號肽序列,3’端有3.5個正向重復序列單位。Chia等證實:gtfC緊靠gtfB下游,與gtfB有高度的同源性,DNA印跡分析得出多數(shù)同源基因含7.3kb的PstⅠ片段,有3個開放閱讀框架;GTF-SI蛋白質(zhì)整體呈親水性,由1375個氨基酸殘基組成,序列中幾乎不含半胱氨酸。Ooshima等發(fā)現(xiàn),只含一個編碼WIG的gtf拷貝的變異鏈球菌合成WIG的能力差,不能實現(xiàn)在牙齒光滑面的定植,但插入gtfC后可增強其合成WIG的能力,從而使其能在牙齒光滑面定植。變異鏈球菌的許多菌株均可與葡聚糖反應并發(fā)生凝集,其分泌的GTF-S與葡聚糖有高度的親和力,變異鏈球菌表面還有非酶性GBP。GTF還存在于人的唾液中,可進入早期獲得性膜并合成葡聚糖,為GBP提供受體,從而直接參與牙面的初始定植。3影響粘土環(huán)境因素的環(huán)境因素3.1變異鏈球菌組織主要功能成分唾液對變異鏈球菌在牙面的定植起重要的調(diào)節(jié)作用。唾液中存在的可與變異鏈球菌反應、誘導其凝集的唾液凝集素(salivaryagglutinin,SAG),主要通過識別細菌表面蛋白來介導細菌的凝集或黏附。存在于液相中的SAG主要介導細菌凝集,吸附于固相上的SAG則介導細菌的黏附。變異鏈球菌與唾液的作用有如下幾點。其一,不同的變異鏈球菌株,其表面的黏結(jié)素不同,不同的唾液組分促進了不同菌株的黏附。變異鏈球菌的黏附主要為黏蛋白和淀粉酶所促進,倉鼠鏈球菌(a)主要由富脯蛋白和淀粉酶促進,大鼠鏈球菌(b)由富脯蛋白和IgA促進,表兄鏈球菌則不受唾液成分的影響。其二,不同狀態(tài)的SAG對變異鏈球菌的黏附作用不同。溶液中的SAG可誘導細菌凝集或通過封閉細菌表面唾液結(jié)合點,有利于消除細菌;SAG吸附于牙面后構(gòu)型可發(fā)生改變,暴露出變異鏈球菌黏結(jié)素的結(jié)合位點,促進黏附。其三,唾液成分空間構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)對變異鏈球菌黏附有影響。一些SAG經(jīng)理化處理降解變性后,分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象發(fā)生改變,失去了與變異鏈球菌結(jié)合的能力。其四,不同個體的唾液對變異鏈球菌黏附定植的影響和凝集變異鏈球菌的能力不同,且唾液的凝集力同變異鏈球菌感染水平呈負相關(guān)。牛奶中的乳鐵蛋白(lactoferritin,LF)對SAG與細菌的結(jié)合具有抑制作用,且呈劑量依賴性。其中,主要的功能成分是LF411(473538位氨基酸殘基)片段。盡管LF是一種離子結(jié)合型蛋白,其離子結(jié)合能力會影響其生物學功能,但是在LF411片段上并沒有離子結(jié)合位點,且LF411與半胱氨酸清道夫受體家族P-2片段的結(jié)合也不需要離子的存在。目前,尚不太清楚LF對變異鏈球菌黏附的具體機制,需進一步深入研究。Oli等發(fā)現(xiàn),當變異鏈球菌編碼PAc的基因被取代后,其與GP-340的凝集和黏附活性受到不同程度的抑制。針對PAc不同位點的單克隆抗體可阻斷變異鏈球菌與SAG的黏附,而多克隆抗體的阻斷作用則更強。3.2基于葡萄糖的初始黏附素姜穎等發(fā)現(xiàn),質(zhì)量分數(shù)5.0%的葡萄糖組黏附力最強,0.2%的葡萄糖組黏附力最低,1.0%的葡萄糖組黏附力界于兩者之間,即一定范圍內(nèi)高質(zhì)量分數(shù)的葡萄糖可促進變異鏈球菌的初始黏附。這既可能緣于充裕的葡萄糖為變異鏈球菌合成蛋白質(zhì)提供了更多的前體和能源,有利于變異鏈球菌表面黏附素的表達,促進變異鏈球菌spaP基因的表達;也可能緣于充裕的葡萄糖影響轉(zhuǎn)肽酶SrtA和內(nèi)源性表面蛋白釋放酶的活性,但其確切的分子機制是今后的研究方向。3.3ph對變異鏈球菌的影響在pH5.5的酸性環(huán)境中,初始黏附能力較強和較弱變異鏈球菌菌株的spaP表達均明顯下降;不過在pH為酸性或中性的環(huán)境中,初始黏附力強的變異鏈球菌的spaP表達均明顯高于初始黏附力弱的變異鏈球菌。pH對變異鏈球菌某些基因的表達及其蛋白的質(zhì)和量都有重要的影響。Browngardt等發(fā)現(xiàn),糖類和pH對于變異鏈球菌的主要毒力因子ftf和gtf-BC的表達起重要的調(diào)控作用。變異鏈球菌能耐受惡劣環(huán)境主要得益于其能產(chǎn)生一些應激蛋白,這些蛋白通過折疊新合成的或者變性的蛋白質(zhì)聚集、轉(zhuǎn)運、降解細胞蛋白而在細胞的代謝中起重要的作用。酸性環(huán)境使變異鏈球菌的spaP表達下調(diào),可能緣于在酸性環(huán)境中變異鏈球菌傾向于合成更多的應激蛋白以耐受環(huán)境的刺激,而其他非應激蛋白的合成受到了抑制。酸性環(huán)境抑制變異鏈球菌的spaP表達,可能是酸性環(huán)境中變異鏈球菌初始黏附下降的原因之一。在不同pH環(huán)境中,初始黏附力強的變異鏈球菌菌株的spaP表達總體上高于黏附力弱的菌株,即變異鏈球菌黏附力可能與其黏附毒力因子的基因表達有關(guān)。更好地闡釋變異鏈球菌的黏附機制,有利于發(fā)現(xiàn)控制牙菌斑生物膜形成的有效措施,可更有針對性地預防齲病的發(fā)生。3.4蔗糖質(zhì)量分數(shù)對變異鏈球菌黏附的影響壁相關(guān)蛋白(wall-associatedprotein,WAP)A又稱抗原A、抗原Ⅲ,是一種Mr為2.9×104的表面蛋白,編碼基因約長1359bp。在Qian等插入滅活變異鏈球菌的wapA后,其突變株的集聚能力和蔗糖依賴性黏附能力分別下降了52%和40%,證實WapA在變異鏈球菌蔗糖依賴性黏附中起著非常重要的作用。Zhu等也發(fā)現(xiàn),wapA突變株形成的鏈明顯變短,細菌間聚集明顯減少,細胞表面超微結(jié)構(gòu)改變,細胞表面黏性下降。隨著環(huán)境的改變,生物膜中細菌的許多生物活性和功能發(fā)生相應的變化。蔗糖是人類食用較多的糖類之一,所合成的水不溶性細胞外多糖參與變異鏈球菌蔗糖依賴性黏附,蔗糖的供給情況是影響變異鏈球菌黏附的另一主要環(huán)境因素。為明確蔗糖促進變異鏈球菌黏附的內(nèi)在機制,有研究檢測在不同蔗糖質(zhì)量分數(shù)環(huán)境中,參與變異鏈球菌蔗糖依賴性黏附wapA的表達情況。結(jié)果顯示,隨著蔗糖質(zhì)量分數(shù)(0.5%、1%、5%)的增加,黏附性較強的變異鏈球菌菌株wapA表達上調(diào),黏附性較弱的菌株wapA表達先上調(diào)而后下降,但其變化差異無統(tǒng)計學意義。即在一定質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi),蔗糖質(zhì)量的增加對變異鏈球菌wapA表達的影響不大。在不同質(zhì)量分數(shù)的蔗糖環(huán)境中,黏附性較強的變異鏈球菌