4GC3GC課件 北京大學(xué)

5.3HPLC實(shí)踐1在這一部分您將學(xué)習(xí):如何為樣品分析設(shè)置HPLC系統(tǒng)，包括:溶劑處理.流動(dòng)相準(zhǔn)備.灌注HPLC.色譜柱安裝和平衡.系統(tǒng)性能檢驗(yàn)。

2溶劑處理

溶劑特性(技術(shù)指標(biāo))純度

黏度

折光指數(shù)

沸點(diǎn)

毒性

UV透明/UV-截止

溶解性

3溶劑相溶性名稱乙酸丙酮乙腈苯丁醇四氯化碳氯仿環(huán)己烷環(huán)戊烷二氯乙烷二氯甲烷二甲基甲酰胺二甲亞砜二氧六環(huán)乙酸乙酯乙醇乙醚庚烷己烷甲醇甲乙酮I-辛烷戊烷I-丙醇四氯乙烷四氫呋喃甲苯丁醇I-丙醇二丙醚三氯乙烷乙酸丙酮乙腈苯四氯化碳氯仿環(huán)戊烷環(huán)己烷二氯乙烷二氯甲烷二甲基甲酰胺二甲亞砜二氧六環(huán)乙酸乙酯乙醇乙醚庚烷己烷甲醇甲乙酮I-辛烷戊烷四氯乙烷

四氫呋喃甲苯水二甲苯三氯乙烷水r二甲苯二丙醚不相溶相溶異丙醇是一種理想的過(guò)度溶劑4溶劑的UV-截止/透明溶劑UV截止(nm)乙腈190水190環(huán)己烷195己烷200甲醇l210乙醇210乙醚220二氯甲烷220氯仿240四氯化碳265四氫呋喃280(220)甲苯285UV截止是用1cm比色池，以空氣為參比測(cè)定時(shí)吸光度為1的波長(zhǎng)。5流動(dòng)相準(zhǔn)備主要步驟

量取每種溶劑的適當(dāng)體積

混合溶劑

加入緩沖液和添加劑*流動(dòng)相過(guò)濾

流動(dòng)相脫氣6灌注HPLC系統(tǒng)7灌注HPLC系統(tǒng)8灌注HPLC系統(tǒng)9灌注HPLC系統(tǒng)10灌注HPLC系統(tǒng)11灌注HPLC系統(tǒng)12灌注HPLC系統(tǒng)13灌注HPLC系統(tǒng)14灌注HPLC系統(tǒng)15灌注HPLC系統(tǒng)16灌注HPLC系統(tǒng)Flow沖洗閥廢液毛細(xì)管17樣品準(zhǔn)備尼龍-親水性膜，過(guò)濾水和以水為溶劑的樣品,121oC自動(dòng)分解,pH范圍3-12,不能用濃酸特氟隆-憎水性膜，耐溶劑、酸和堿.該濾膜一般用于非水樣品.pH范圍1-14.醋酸纖維素-水相生物樣品的良好濾膜，蛋白質(zhì)保留性能弱.pH范圍4-8.聚偏二氯乙烯-耐大部分溶劑,與蛋白質(zhì)結(jié)合力弱.pH2-12.超濾膜-用于生物樣品的分子量截止濾膜.硝化纖維素-有高的蛋白質(zhì)保留性能.固相萃取

最基本的要求-過(guò)濾樣品18樣品準(zhǔn)備將樣品溶解在流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱的溶劑中

進(jìn)樣體積應(yīng)盡可能小樣品溶解在流動(dòng)相中樣品溶解在較強(qiáng)的溶劑中19色譜柱保存

避免對(duì)色譜柱施加任何物理應(yīng)力

柱兩端封好避免溶劑揮發(fā)干

用適當(dāng)?shù)娜軇氐讻_洗后再保存

記錄色譜柱的使用歷史20色譜柱安裝每根色譜柱均標(biāo)明了流動(dòng)相的流動(dòng)方向!流動(dòng)方向是用箭頭或文字標(biāo)示的.不要改變此流動(dòng)方向,否則會(huì)降低色譜柱性能.21色譜柱安裝需要什么:正確的接頭以防止任何泄漏.保護(hù)柱以保護(hù)分析柱

正確的工具22色譜柱安裝（續(xù)）實(shí)用提示:

用手?jǐn)Q緊

再用扳手?jǐn)Q1/4圈23色譜柱平衡用流動(dòng)相平衡

避免對(duì)色譜柱的壓力沖擊.

反相色譜需要5-10倍柱體積的流動(dòng)相進(jìn)行平衡.

保證結(jié)果的重現(xiàn)性.24色譜柱測(cè)試

新的色譜柱應(yīng)當(dāng)附帶性能測(cè)試結(jié)果（合格證）!

每使用一次都要逐項(xiàng)記錄:

反壓

流動(dòng)相

溫度

樣品類型

保存條件(溶劑)基于這些色譜柱使用歷史，可以用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試混合物檢驗(yàn)色譜柱的性能.25色譜柱維護(hù)

使用后選擇合適的溶劑沖洗色譜柱，將柱中保留作用很強(qiáng)的樣品組分徹底沖洗出去.

不要用100%的水保存色譜柱，否則會(huì)生長(zhǎng)細(xì)菌丙并堵塞色譜柱.

如果想保持色譜柱性能，就不要打開(kāi)柱兩端的封頭，也不要重新裝填固定相.

在最佳流速條件下使用色譜柱-避免高流速.不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠或鍵合相色譜柱.

控制流動(dòng)相的pH在色譜柱適合的范圍.26系統(tǒng)校驗(yàn)-常規(guī)原則:可以使用確定的測(cè)試混合物和方法校驗(yàn)HPLC系統(tǒng)(包括色譜柱)的性能。最少通過(guò)三次進(jìn)樣分析.系統(tǒng)校驗(yàn)的準(zhǔn)備工作:

用流動(dòng)相灌注了HPLC系統(tǒng).

平衡色譜柱.

檢測(cè)器基線穩(wěn)定.

無(wú)泄漏.

系統(tǒng)準(zhǔn)備好進(jìn)樣27系統(tǒng)校驗(yàn)-常規(guī)（續(xù)）測(cè)試樣品的要求:

樣品是明確表征的.

檢測(cè)器響應(yīng)是已知的.

樣品含有多個(gè)組分.Testdesign:用確定的測(cè)試方法分析測(cè)試樣品.將所得結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相比.結(jié)果若處于設(shè)定的范圍，則說(shuō)明系統(tǒng)性能良好，可以使用.!!

這與OQ測(cè)試或PV測(cè)試是不可比的!!28小結(jié)準(zhǔn)備流動(dòng)相

灌注HPLC系統(tǒng)

安裝色譜柱

啟動(dòng)檢測(cè)器(對(duì)于UV檢測(cè)器至少預(yù)熱20分鐘)

平衡色譜柱準(zhǔn)備樣品

記錄檢測(cè)器響應(yīng)-基線穩(wěn)定

用測(cè)試樣品和測(cè)試方法進(jìn)行系統(tǒng)校驗(yàn)

將結(jié)果與預(yù)期結(jié)果比較(極限值)

記錄結(jié)果(作為對(duì)照)

如果有任何故障/出錯(cuò)，就記錄下來(lái)

如果系統(tǒng)校驗(yàn)合格,您就可進(jìn)行樣品分析YouareReadyforSampleAnalyses29復(fù)習(xí)1.您在進(jìn)行一個(gè)常規(guī)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)基線周期性地波動(dòng).壓力讀數(shù)上下波動(dòng)。問(wèn)題的原因是什么?您如何