細胞工程與作物育種

第九部分細胞工程與作物育種基本概念

作物細胞工程（plantcellengineering)是以細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一門學(xué)科。它以細胞為基本單位，在體外（invitro）條件下進行培養(yǎng)、繁殖或人為地使細胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿產(chǎn)生某種物質(zhì)的過程。

植物細胞細胞工程動物細胞工程理論基礎(chǔ)：

細胞的全能性（celltotipotency）。

因為細胞核內(nèi)有保持物種遺傳性所需要的全套遺傳物質(zhì)所以高度分化的體細胞具有發(fā)育成一個生物體的能力。植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交全能性的高低：

①受精卵＞配子（如卵細胞）＞體細胞②分化程度低的細胞＞分化程度高的細胞③植物細胞＞動物細胞

第一節(jié)細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)組織培養(yǎng)（tissueculture，invitroculture）通常用于所有類型的植物無菌培養(yǎng)技術(shù)。

包括：胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)）

外植體（explant）是指用來進行培養(yǎng)的植物體某一部分組織的統(tǒng)稱。選擇外植體要考慮：①基因型；②植物的合適部位；③考慮它的合適年齡

步驟：取外植體、消毒、接種于培養(yǎng)基上、置于一定條件下培養(yǎng)

一、培養(yǎng)基及其組成：

基本培養(yǎng)基：MS，N6等

植物生長調(diào)節(jié)劑：生長素、細胞分裂素、赤霉素等

能量物質(zhì)：蔗糖等其他添加物酵母粉、椰子汁、水解乳蛋白、酪蛋白水解物等

無機鹽和水大量元素C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl微量元素Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na水蒸餾水、雙蒸水或去離子水有機化合物

糖碳源和能源氨基酸類有機氮源維生素類

維生素b1、維生素b6、生物素、煙酸、葉酸等生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長素IAA、NAA、2,4-D、IBA細胞分裂素天然：6-BA、KT；人工：ZT、2-iP赤霉素GA3成份不定物質(zhì)椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥瓊脂從海藻中提取的一種高分子碳水化合物培養(yǎng)基的成分MS大量(10×)800mlMS微量(100×)400mlKNO3

15.20gCuSO4.5H2O0.001gMgSO4.7H2O2.96gCoCl2.6H2O0.001gNH4NO3

13.20gNa2MoO4.2H2O0.01gCaCl2.2H2O3.52gMnSO4.H2O0.676gKH2PO4

1.36gZnSO4.7H2O0.344gH3BO30.248gKI0.0332gMS有機(100×)

200ml改良1/2MS大量(10×)

400mlGlycine0.04gKNO33.80gVB10.008gMgSO4.7H2O0.74gVB60.01gNH4NO33.30g煙酸0.01gCaCl2.2H2O0.88g肌醇2.00gKH2PO40.34g二、培養(yǎng)基的配制(1)水和藥品水必須采用蒸餾水或去離子水，藥品最好采用分析純，至少是化學(xué)純藥品。(2)母液的配置為方便培養(yǎng)基的制備，現(xiàn)將培養(yǎng)基的各種成份分類配成濃縮的母液，正式配制時按規(guī)定用量稀釋混合。（3）制備培養(yǎng)基---特別注意PH值（4）培養(yǎng)基的消毒主要有高溫高壓滅菌和過濾滅菌兩種方法。三、無菌操作方法（一）消毒劑消毒劑使用濃度（%）消除難易消毒時間（min）消毒效果次氯酸鈉20易5~30很好次氯酸鈣9~10易5~30很好過氧化氫10~12最易5~15好溴水1~2易2~10很好硝酸銀1較難5~30好氯化汞0.1~1較難2~15最好抗生素4~50mg/L中30~60較好

（二）無菌操作（三）無菌培養(yǎng)第二節(jié)體細胞無性系變異與作物改良

一、

基本概念

植物體細胞在離體條件下，以及在離體培養(yǎng)之前，會發(fā)生各種遺傳和不遺傳的變異。

無性系變異（somaclonalvariation）：將遺傳上的變異稱為無性系變異；

變異體（variant）：不加任何選擇壓力而篩選出的變異個體；

突變體（mutant）：經(jīng)過施加某種選擇壓力所篩選出的無性系變異。二：體細胞變異的遺傳基礎(chǔ)

（一）細胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)

1.外植體細胞先存在的變異

2.染色體數(shù)量變異

3.染色體結(jié)構(gòu)變異，斷裂和重組，相互易位，缺失等。（二）細胞分裂機制與遺傳變異

1.細胞脫分化后的細胞異常分裂

2.無絲分裂（三）分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)

1.基因突變

2.DNA堿基修飾

3.基因重排

4.DNA總量的變化

5.轉(zhuǎn)座因子的激活Comparisonofthetransgenicplantsbyparticlebombardmentwithpollen-tubepathway

三:體細胞無性系變異的廣泛性和多樣性四:體細胞無性系變異的分子檢測（一）酶譜分析檢測變異（二）RFLP檢測變異（三）RAPD檢測變異（四）其他分子檢測

五：細胞和組織培養(yǎng)與作物育種（一）抗性抗病抗除草劑抗寒耐鹽耐旱Streptomycinresistance

resistanttoLibertyherbicidesusceptibletoLibertyherbicide

（二）、雄性不育突變體利用體細胞變異產(chǎn)生雄性不育系證明是一條可行的途徑。

（三）、各種形態(tài)特征(株高)和生物學(xué)特性(生育期)突變體體細胞變異在形態(tài)特征和生物特征都有廣泛的變異。優(yōu)良品種細胞培養(yǎng)R0R1群體改良的體細胞克隆遺傳穩(wěn)定性測試育成新品系區(qū)域試驗審定投入生產(chǎn)田間試驗多點田間試驗繼續(xù)田間試驗,種子富集互交測試確定遺傳方式利用體細胞克隆變異育種的技術(shù)路線體細胞無性系變異的不足：

1.產(chǎn)生的變異多，變異類型復(fù)雜2.變異的方向難以控制，難以預(yù)測3.篩選出的突變性狀有喪失抗性的趨勢4.多次繼代后分化能力喪失5.無性系變異更適合營養(yǎng)繁殖作物第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)和

體細胞雜交

原生質(zhì)體：指用特殊方法脫去細胞壁的、裸露的、有生活力的原生質(zhì)團。就單個細胞而言，除了沒有細胞壁外，它具有活細胞的一切特征。

一.原生質(zhì)體培養(yǎng)的利用途徑①通過原生質(zhì)體培養(yǎng)可以制造單細胞無性系。②原生質(zhì)體可以作為基因轉(zhuǎn)化的受體，使之接受外源遺傳物質(zhì)（如細胞器、染色體或DNA片段等）產(chǎn)生新的變異類型。③利用原生質(zhì)體進行許多基礎(chǔ)性研究，如細胞生理、基因調(diào)控、分化和發(fā)育等。④細胞融合即體細胞雜交。

體細胞雜交（somatichybridizatioin）又稱原生質(zhì)融合（protoplastfussion），是指兩種原生質(zhì)體間的雜交。

胞質(zhì)雜種（cytohybrid）：是指體細胞雜交過程中有意識地去除（或殺死）某一親本的細胞核，得到的將是一個親本細胞核和兩個親本細胞質(zhì)的雜種細胞。

二植物體細胞雜交（原生質(zhì)體融合）

體細胞雜交的特點

最大特點是：有可能使有性雜交不親和的雙親之間雜交成功，也就是說在體細胞水平上的雜交，其雙親間的親和性或相容性似乎有所提高，因而有可能擴大雜交親本和植物資源的利用范圍。

體細胞雜交的環(huán)節(jié)

①原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)；②原生質(zhì)體間的融合；③融合后雜種細胞的選擇；④誘導(dǎo)雜種細胞產(chǎn)生愈傷組織和再生植株。

Isolationofriceprotoplastsfromgreentissue

原生質(zhì)體雜交的過程誘導(dǎo)分化1）選擇合適的實驗材料2）酶的類型和處理條件：果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等1、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)3）原生質(zhì)體計數(shù)0.25MNaNO3和高濃度Ca2+,聚乙二醇（PEG）加高濃度Ca2+和高pH值，電融合技術(shù)2、原生質(zhì)體融合關(guān)鍵是融合劑的選擇：融合方式原生質(zhì)體融合有兩種融合方式即對稱融合和非對稱融合。這兩種融合方式都能產(chǎn)生三種類型的雜種：綜合了雙親全部遺傳物質(zhì)的對稱雜種；部分遺傳物質(zhì)發(fā)生丟失的非對稱雜種；只具有融合雙親一方核遺傳物質(zhì)的胞質(zhì)雜種。

對稱融合即雙親的核質(zhì)組裝在一起的融合。

非對稱融合指在融合前對一方親本原生質(zhì)體施加一定的處理，鈍化其細胞質(zhì),再和另一方原生質(zhì)體融合，從而得到非對稱雜種或胞質(zhì)雜種。3、雜種和胞質(zhì)雜種的鑒別

A

花部和營養(yǎng)體的形態(tài)觀察；B細胞學(xué)檢測C生化鑒定4、分子生物學(xué)分析原生質(zhì)體培養(yǎng)與作物遺傳改良1.克服生殖障礙，創(chuàng)新新種質(zhì)原生質(zhì)體融合是克服有性雜交不親和、植物多胚特性等生殖障礙的有效手段，并且能轉(zhuǎn)移多基因控制的性狀。２．轉(zhuǎn)移有利性狀，改善作物品質(zhì)

3、轉(zhuǎn)移部分染色體，獲得非對稱雜種

4、轉(zhuǎn)移細胞質(zhì)基因組，得到胞質(zhì)雜種

體細胞雜交面臨的困難

1、融合特性的高效性

2、雜種細胞的培養(yǎng)和選擇

3、雜種的遺傳穩(wěn)定性控制

1、誘導(dǎo)融合及雜種細胞的各種生理、生化、

遺傳機理的研究

2、電融合的程序化控制研究

3、各種類型原生質(zhì)體（胞質(zhì)體、核質(zhì)體、

細胞器）的制備技術(shù)研究

4、雜種細胞培養(yǎng)技術(shù)的程序化研究體細胞雜交研究的發(fā)展趨勢第四節(jié)單倍體細胞培養(yǎng)

單倍體細胞培養(yǎng)及育種利用

花藥培養(yǎng)(antherculture)是由單個花粉粒在合成培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)獲得完整植株的技術(shù)。也是獲得單倍體的一種技術(shù)，我國花藥培養(yǎng)始于1970年，目前技術(shù)不斷在完善。通過花藥培養(yǎng)育成的品種如：中花9號，在北方高產(chǎn)并高抗稻瘟病。浙粳66具有早熟、高產(chǎn)、抗白葉枯病等特點。合單76-085抗寒，能種植在緯度48°N左右的松花江流域?；ㄋ幣囵B(yǎng)的特點及在水稻品種改良上的應(yīng)用(1)后代的快速純合；(2)排除顯隱性的干擾，使配子類型在植株水平上充分體現(xiàn)，提高選擇效率；(3)結(jié)合誘變