地黃寡糖對hepg2細胞體外降糖作用及hepg2細胞胰島素抵抗的影響

地黃寡糖對hepg2細胞體外降糖作用及hepg2細胞胰島素抵抗的影響

黃鼠狼在中國用于治療糖尿病已有幾千年的歷史。地黃寡糖(Rehmanniaglutinosaoligosaccharide,ROS)是地黃的主要成分之一,具有改善造血、促進免疫、抗腫瘤等作用。作者以往的研究表明,ROS無論以腹腔注射或灌胃均可降低四氧嘧啶(ALX)糖尿病大鼠的血糖,對去胸腺大鼠及老年大鼠受損的糖代謝(impairedglucosemetabolism)有改善作用,而且在2型糖尿病大鼠模型上具有降血糖、降血脂作用;在體外地黃寡糖能夠改善地塞米松誘導的胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞,促進葡萄糖消耗,其作用效果與羅格列酮類似。為了進一步研究地黃寡糖對胰島素抵抗的作用,本實驗采用高劑量胰島素誘導的HepG2細胞胰島素抵抗模型,研究地黃寡糖對HepG2細胞體外降糖作用及在HepG2細胞胰島素抵抗模型上的藥理作用。1材料表面1.1細胞培養(yǎng)和轉染地黃經(jīng)中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所劉云教授鑒定為懷慶地黃RehmanniaglutinosaLibosch.。ROS由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院全軍臨床藥理基地提供,其中四聚糖占60%,三糖占20%,其余為單糖或二糖;HepG2細胞由中國科學院蘭州近代物理研究所金小東教授惠贈;胰島素(批號024K0988)和無酚紅DMEM培養(yǎng)基(批號074K8300)購自Sigma公司;RPMI1640(批號1243098)培養(yǎng)基購自Gibco公司;MTT(批號1313B11)購自aMResco公司;優(yōu)級新生小牛血清(批號20060509)購自蘭州民海生物工程有限公司;馬來酸羅格列酮片(rosiglitazonemaleatetablets)購自葛蘭素史克(天津)有限公司(批號05080092);葡萄糖臨床檢測試劑盒購自四川邁克公司(批號0406081)。1.2n,b210s電子天平酶標儀(ThermoElectron,美國),倒置顯微鏡(OLYMPUSIX71,日本),BP210S電子天平(賽多利斯有限公司,德國)等。2方法2.1培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細胞復蘇后用含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液轉入100mL培養(yǎng)瓶中,在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞貼壁長滿后,傾去培養(yǎng)基,用0.25%胰蛋白酶消化,每3d按1∶3比例傳代1次,取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。2.2小鼠血清中葡萄糖的檢測將HepG2細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基轉入96孔板中,待細胞長至80%～90%融合后,更換無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12h,待細胞適應無血清的環(huán)境后再將培養(yǎng)基移出,換上無小牛血清的含藥培養(yǎng)基,將細胞分為空白組、羅格列酮組(終劑量為3.4mg·L-1),ROS處理組(終劑量分別為0.1,0.3,1.0,3.0,10,30mg·L-1)。上述各組再分別加胰島素(10nmol·L-1)處理和不加胰島素處理。孵育24h后,用葡萄糖臨床檢測試劑盒檢測培養(yǎng)基上清的葡萄糖含量。以不鋪細胞的空白孔為空白對照,計算24h葡萄糖消耗量。不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液由低糖DMEM加入不同量的葡萄糖后抽濾而成。2.3mtt法培養(yǎng)mtt葡萄糖消耗實驗結束后,移出培養(yǎng)液,將5g·L-1的MTT原液與無血清DMEM培養(yǎng)基按體積1∶9配成MTT培養(yǎng)液,每孔加入MTT培養(yǎng)液,37℃繼續(xù)培養(yǎng),4h后終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液,每孔加入200μL的二甲基亞砜,震蕩器震蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶標儀570nm波長下測定各孔的吸光度(A),以監(jiān)測細胞的數(shù)目與活力。2.4固定型hepg2細胞胰島素抵抗模型的建立按文獻方法稍作改進。將處于對數(shù)生長期的細胞消化后,用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為106個/L,轉入96孔板中。待細胞單層貼壁后,加入新配制的含有胰島素的培養(yǎng)液,并設無胰島素的空白孔,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育36h。棄去培養(yǎng)液,先用0.01mol·L-1PBS洗滌1次,再用pH6.0的培養(yǎng)基37℃孵育20min。重復上述過程1次,最后用0.01mol·L-1PBS洗滌后,換上無血清的培養(yǎng)基。孵育24h后,用葡萄糖臨床試劑盒檢測培養(yǎng)基的葡萄糖含量。以不鋪細胞的空白孔為空白對照,計算24h各組細胞的葡萄糖消耗量。采用此方法通過優(yōu)化胰島素濃度和胰島素作用時間建立適宜的高濃度胰島素誘發(fā)的HepG2細胞胰島素抵抗模型。在以高胰島素誘發(fā)HepG2細胞建立的胰島素抵抗模型后,分別設空白組、胰島素抵抗模型組、羅格列酮組(終劑量為3.4mg·L-1),ROS處理組(終劑量分別為0.1,1.0,3.0,10,30,100mg·L-1)。上述各組均包括加胰島素(10nmol·L-1)處理組和不加胰島素處理組。在藥物處理24h后檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量。以不鋪細胞的空白孔為空白對照,計算24h各組細胞的葡萄糖消耗量。2.5統(tǒng)計方法測定的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0統(tǒng)計軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計學分析,以xˉ±sxˉ±s表示,組間差異的顯著性采用t檢驗方法進行。3結果3.1細胞葡萄糖消耗量如表1所示,與空白組相比,在中劑量(11.1mmol·L-1)葡萄糖且不含胰島素的條件下,地黃寡糖各質(zhì)量濃度都能夠促進HepG2細胞的葡萄糖消耗,在0.1～30mg·L-1,尤以10mg·L-1的效果最好,可使細胞的葡萄糖消耗量增加71.64%(P<0.01),而羅格列酮也能使細胞的葡萄糖消耗量增加36.46%(P<0.05);在培養(yǎng)基中加入胰島素后,地黃寡糖各質(zhì)量濃度仍能增加HepG2細胞的葡萄糖消耗,并且在地黃寡糖各質(zhì)量濃度中,10mg·L-1的作用效果最佳,可使培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量增加61.65%(P<0.01),而羅格列酮使HepG2細胞的葡萄糖消耗量增加43.06%(P<0.01)。3.2mmoll-1和mmpg2細胞自身葡萄糖的消耗量消耗的影響如表2所示,高糖本身就可以上調(diào)HepG2葡萄糖消耗量,當培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度從5.5mmol·L-1上升到22.2mmol·L-1時,HepG2細胞本身的葡萄糖消耗量增加了2.1倍。與空白組相比,在葡萄糖濃度為5.5～22.2mmol·L-1,地黃寡糖均能夠促進HepG2細胞的葡萄糖消耗(P<0.05)。羅格列酮雖然也能夠促進HepG2對葡萄糖的消耗,但未見統(tǒng)計學差異。3.3不同劑量充填對hepg2細胞增殖的影響如表3所示,與空白組相比,在不含胰島素時,低劑量的地黃寡糖(0.1～3mg·L-1)可抑制HepG2細胞的增殖,且0.1mg·L-1時抑制效果最好(P<0.01),高劑量地黃寡糖(10～30mg·L-1)則促進HepG2細胞的增殖(P<0.001);而在含胰島素時,高劑量地黃寡糖仍能夠促進HepG2增殖(P<0.001)。羅格列酮在不含胰島素時抑制HepG2細胞增殖,而在含胰島素時促進HepG2細胞增殖,但未見統(tǒng)計學差異。3.4moll-1的雙組分法如表4顯示,與空白組比較,胰島素濃度由10-8mol·L-1增加到10-6mol·L-1時,胰島素組對葡萄糖的攝取逐漸減少,10-6mol·L-1時達到最小(P<0.001),且使培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量降低20.22%。而如表5所示,在10-6mol·L-1的胰島素作用不同時間內(nèi),隨著胰島素作用時間的延長,胰島素組對葡萄糖的攝取均比空白組低,在36,48,60h時間點,使胰島素組的葡萄糖消耗量分別降低13.16%,17.07%,30.53%,并且在60h時兩者葡萄糖消耗差別最大,統(tǒng)計學處理差異均具有顯著性(P<0.001)。3.5對胰島素抵抗的細胞數(shù)據(jù)的影響如表6所示,經(jīng)過高胰島素作用后,模型組對胰島素的敏感性降低,對葡萄糖攝取減少,使葡萄糖消耗量降低35.85%,說明造模成功(與空白組比較,P<0.001)。加藥處理24h后,與模型組相比,在中(11.1mmol·L-1)葡萄糖且不含胰島素的條件下,地黃寡糖各劑量(0.1～100mg·L-1)均能促進胰島素抵抗HepG2細胞模型的葡萄糖消耗,并且在10mg·L-1時使培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量增加51.34%(P<0.001)。此外,羅格列酮也能促進胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗,但統(tǒng)計學處理差異無顯著性;在培養(yǎng)基中加入胰島素后,地黃寡糖各濃度組均能促進胰島素抵抗HepG2細胞模型的葡萄糖消耗,以10mg·L-1的效果最好,可使胰島素抵抗細胞的葡萄糖消耗量增加29.04%(P<0.001)。羅格列酮也能使培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量增加10.15%(P<0.01)。4對正常hepg2細胞糖代謝的影響胰島素抵抗是多種代謝相關疾病的共同病理生理基礎及共有的危險因素,已成為2型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié),因此可從防治IR及其糖脂代謝紊亂入手從中藥中尋找優(yōu)良的治療糖尿病新藥。本實驗選用人源肝癌細胞——HepG2細胞株,研究地黃寡糖對胰島素抵抗HepG2細胞的藥理作用。HepG2細胞表面的胰島素受體數(shù)目受胰島素水平和作用時間的調(diào)節(jié),當胰島素受體數(shù)目下調(diào)至一定程度時,則該細胞對胰島素的作用產(chǎn)生抗性。本實驗結果表明,不同濃度胰島素誘發(fā)HepG2細胞胰島素抵抗模型時,以10-6mol·L-1時誘發(fā)的胰島素抵抗模型效果最佳;同時對胰島素作用時間的研究發(fā)現(xiàn),胰島素(10-6mol·L-1)作用36,48,60h后,HepG2細胞對葡萄糖的攝取逐漸減少,但在胰島素作用36h后細胞活力開始下降,死亡增多。因此,綜合以上情況確定高胰島素誘發(fā)HepG2細胞胰島素抵抗模型的最佳方案為用10-6mol·L-1的胰島素作用HepG2細胞36h,此時HepG2細胞對葡萄糖的利用減少,即發(fā)生葡萄糖攝取和利用的障礙,說明胰島素抵抗模型建立成功。作者在上述條件下研究了地黃寡糖對胰島素抵抗HepG2細胞模型的影響,結果表明地黃寡糖能顯著促進高胰島素誘發(fā)的胰島素抵抗HepG2細胞模型的葡萄糖消耗,使胰島素抵抗細胞的葡萄糖消耗量明顯增加。說明地黃寡糖能夠改善HepG2的胰島素抵抗狀態(tài),增強HepG2細胞對葡萄糖的攝取和利用。實驗結果還表明,無論胰島素存在與否,地黃寡糖均能夠顯著地促進HepG2細胞的葡萄糖消耗,羅格列酮在胰島素的存在下才能明顯地增強HepG2細胞葡萄糖消耗。在5.5～22.2mmol·L-1葡萄糖范圍內(nèi)地黃寡糖均能夠促進HepG2細胞的葡萄糖消耗,尤以5.5mmol·L-1葡萄糖濃度下最為明顯,而羅格列酮在4個葡萄糖濃度范圍內(nèi)對HepG2細胞的葡萄糖消耗影響并不顯著。另外,無論胰島素存在與否,高劑量地黃寡糖均可促進HepG2細胞增殖,而低劑量地黃寡糖僅在不含胰島素時抑制HepG2細胞的增殖;羅格列酮僅在胰島素存在下促進HepG2細胞的增殖。這種現(xiàn)象有待進一步研究。綜合以上結果,作者認為無論胰島素存在與否,地黃寡糖均顯著促進正常HepG2細胞和胰島素抵抗HepG2細胞模型的葡萄糖消耗,改善HepG2細胞的胰島素抵抗,且不同劑量地黃寡糖對HepG2的增殖具有不同的效果,而羅格列酮僅在胰