哺乳動(dòng)物胚胎與配子生物工程技術(shù)

第一節(jié)、胚胎移植

（EmbryoTransplant）定義：將良種母畜配種后的早期胚胎取出，移植到同種、生理狀態(tài)相同的其他母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體。

一、概述提供胚胎的母畜稱為供體（Donor）接受胚胎的母畜稱為受體（Recipient）第1頁，共98頁。二、胚胎移植的過程及意義1、充分發(fā)揮良種母畜的繁殖潛力。2、加速品種改良，擴(kuò)大良種畜群。3、誘產(chǎn)雙胎，提高生產(chǎn)效率。4、防疫需要和克服不孕。5、基礎(chǔ)研究手段。6、滿足畜牧業(yè)現(xiàn)代化的需要。第2頁，共98頁。1、遺傳物質(zhì)來自親代。2、營養(yǎng)物質(zhì)來自受體。

三、胚胎移植的特點(diǎn)第3頁，共98頁。四、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)和原則1、母畜發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育；2、早期胚胎呈游離狀態(tài)；3、胚胎移植基本上不存在免疫問題；4、胚胎與供受體的關(guān)系。(一)生理學(xué)基礎(chǔ)第4頁，共98頁。(二)胚胎移植的基本原則

1、胚胎移植前后所處環(huán)境的一致性。

⑴種屬的一致性；⑵生理的一致性；⑶收集和移植部位的一致性。

第5頁，共98頁。2、胚胎發(fā)育的期限

不超過周期黃體的壽命。通常是在供體發(fā)情配種后3-8天內(nèi)收集胚胎。第6頁，共98頁。3、胚胎的質(zhì)量0-2d1-3d2-3d3-5d4-5d5-6d5-7d7-8d7-9d8-10d9-11d第7頁，共98頁。五、胚胎移植的技術(shù)過程供受體的選擇；供體的超排處理與配種和受體的同期發(fā)情；胚胎的收集；胚胎的檢查；胚胎移植。第8頁，共98頁。牛胚胎移植示意圖第9頁，共98頁。Boer胚胎移植示意圖優(yōu)良公Boer羊供體母Boer羊超排手術(shù)取胚受體母山羊同期發(fā)情后代第10頁，共98頁。(一)供體和受體的選擇供體：良種母畜。受體：良好的繁殖性能，健康、體況中上等。

第11頁，共98頁。(二)供體超數(shù)排卵處理和受體

母畜的同期發(fā)情1、超排目的得到足夠量的合格胚胎。

2、超排方法

第12頁，共98頁。

（發(fā)情9～11天）FSH＋PG法牛超數(shù)排卵發(fā)情后配種或輸精兩次，每隔6h輸一次(為0d)第6～7d沖洗子宮：鹽酸利多卡因尾椎麻醉桑椹胚～早期囊胚第13頁，共98頁。PMSG法牛超數(shù)排卵發(fā)情第16～17d，注射PMSG1500～3000IU隔日注射hCG1000～1500IU24～48h發(fā)情，配種或輸精（為第0d）第6～7d沖洗子宮，獲得桑椹胚～早期囊胚第14頁，共98頁。FSH＋PG法羊超數(shù)排卵

早：FSH（國產(chǎn)，7.5mg/瓶）；晚：FSH

早：FSH；晚：FSH早：FSH+PGF2α2ml；晚：FSH24～48h發(fā)情，配種或輸精兩次（為第0d）發(fā)情周期第12～13d（綿羊）、16～18d（山羊）第6d沖洗子宮，獲得桑椹胚～早期囊胚同時(shí)靜脈注射LH100～150IU*國產(chǎn)FSH總量為150～300IU（一）第15頁，共98頁。PMSG法羊超數(shù)排卵發(fā)情周期的12～13d（綿羊）、第16～18d（山羊）注射PMSG800～1500IU24～48h發(fā)情，配種或輸精（為第0d）同時(shí)注射hCG500～750IU第6d沖洗子宮，獲得桑椹胚～早期囊胚（二）第16頁，共98頁。PMSG法小鼠超數(shù)排卵注射PMSG10～20IU48小時(shí)后注射hCG10～20IU，公母合籠24小時(shí)后刺破輸卵管，獲得早期受精卵第17頁，共98頁。20M蔗糖PBS液洗2次。⒊核卵重組技術(shù)：移入供體核3、移植成功率低50-60%.第三節(jié)胚胎顯微操作與供體母畜超排同時(shí)進(jìn)行。缺點(diǎn)：沖卵不徹底，需要沖卵液多用同位素標(biāo)記的Y染色體特異序列的探針，用這一探針與從胚胎細(xì)胞中提取的少量DNA雜交。雄兔于一天中進(jìn)行多次交配，發(fā)現(xiàn)后代中的雌性越來越多。3、胚胎移植基本上不存在免疫問題；第三節(jié)胚胎顯微操作優(yōu)點(diǎn)：對(duì)動(dòng)物損傷小，3、受體母畜的同期發(fā)情與供體母畜超排同時(shí)進(jìn)行。

P4、PGF2a第18頁，共98頁。(三)供體母畜的配種要求：1、優(yōu)良公畜的精液；2、精子活率高、密度大且兩次配種。第19頁，共98頁。同期發(fā)情與超排程序放栓發(fā)情鑒定配種0-910111213141516171819207:00FSH4ml18:00FSH4ml7:00FSH2.5ml18:00FSH2.5ml7:00FSH2ml14:00PG6ml18:00FSH2ml7:00FSH1.5ml14:00取栓18:00FSH1.5ml配種配種檢查黃體沖胚移胚第20頁，共98頁。第21頁，共98頁。(四)胚胎的收集

1、手術(shù)法收集胚胎手術(shù)

優(yōu)點(diǎn)：沖卵比較徹底缺點(diǎn)：手術(shù)對(duì)動(dòng)物剌激性大第22頁，共98頁。從子宮角頂端沖洗輸卵管：牛、羊、兔胚胎在輸卵管中第23頁，共98頁。從輸卵管傘處沖洗輸卵管：豬、馬胚胎在輸卵管中第24頁，共98頁。胚胎在子宮角時(shí)從子宮角上端向基部沖洗第25頁，共98頁。

2、非手術(shù)法收集胚胎優(yōu)點(diǎn)：對(duì)動(dòng)物損傷小，缺點(diǎn)：沖卵不徹底，需要沖卵液多第26頁，共98頁。非手術(shù)法收集胚胎第27頁，共98頁。第28頁，共98頁。(五)胚胎的檢查第29頁，共98頁。第6天收集的胚胎（未揀）1、檢胚第30頁，共98頁。二細(xì)胞至四細(xì)胞胚胎

第31頁，共98頁。2、胚胎鑒定⑴熒光活體染色體醋酸熒光素（FDA，fluoresceindiacetate），培養(yǎng)3-6′，活胚胎顯示熒光，死胎無熒光。

⑵測(cè)定代謝活性法1h測(cè)定葡萄糖的消耗量2-5μg以上。⑶

形態(tài)學(xué)法第32頁，共98頁。原核～8細(xì)胞正常胚胎第33頁，共98頁。桑椹胚~早期囊胚第34頁，共98頁。異常胚胎示意圖未受精卵未受精卵胞質(zhì)中有空泡第35頁，共98頁。卵裂球脫落卵裂球分散卵裂球不規(guī)則受精卵退化第36頁，共98頁。透明帶破裂透明帶不規(guī)則卵圓形透明帶第37頁，共98頁。㈥胚胎的移植手術(shù)法：各種家畜

非手術(shù)法：牛、馬第38頁，共98頁。第39頁，共98頁。(七)供體和受體的觀察健康狀況；是否發(fā)情。第40頁，共98頁。3、一步冷凍法㈡X染色體連鎖酶活力測(cè)定法2、精子活率高、密度大且兩次配種。⒊核卵重組技術(shù)：移入供體核5mol/L蔗糖5′→保存液沖洗3-4→裝槍移植。3、胚胎移植基本上不存在免疫問題；過于年老的或過于年輕的母體常多生雄性;25M蔗糖10′→4℃25%甘油、25%丙二醇30″→液氮定義：將良種母畜配種后的早期胚胎取出，移植到同種、生理狀態(tài)相同的其他母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體。核移植技術(shù)的操作過程2、改進(jìn)非手術(shù)法收集和移植胚胎4、胚胎與供受體的關(guān)系。3、胚胎移植技術(shù)應(yīng)與胚胎切割、胚胎冷凍、⑴TCM-199+胎牛血清+丙酮酸，可加cAMP、血清、生長因子、生殖激素(FSH、17β-雌二醇，hCG)以1℃/分降至-6-7℃并平衡10′2、加速品種改良，擴(kuò)大良種畜群。

六、胚胎移植目前存在的問題和發(fā)展前景。1、超排效果不夠穩(wěn)定。2、胚胎回收率低。3、移植成功率低50-60%.(一)問題第41頁，共98頁。(二)發(fā)展前景

1、提高穩(wěn)定超排效果。2、改進(jìn)非手術(shù)法收集和移植胚胎的技術(shù)和器具.3、胚胎移植技術(shù)應(yīng)與胚胎切割、胚胎冷凍、早期胚胎的性別鑒定等結(jié)合起來。第42頁，共98頁。第二節(jié)胚胎冷凍與體外受精

(一)意義1、建立胚胎庫，保存優(yōu)良種畜與瀕危動(dòng)物資源。2、使胚胎移植不受時(shí)間與地點(diǎn)的限制。3、胚胎運(yùn)輸取代種畜引進(jìn)。一、胚胎冷凍第43頁，共98頁。(二)冷凍原理形成冰晶胞外水分滲透壓升高細(xì)胞脫水、蛋白質(zhì)變性胞內(nèi)水分形成大的冰晶細(xì)胞死亡胞外溶液效應(yīng)抗凍保護(hù)劑胞內(nèi)形成大的冰晶胞外溶液效應(yīng)第44頁，共98頁。冷凍保護(hù)劑：甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇。第45頁，共98頁。(三)冷凍及解凍方法1、緩慢降溫法

以低于0.2-0.8℃/min速度降低到－70℃再投入液氮，解凍速度也不超過25℃/min優(yōu)點(diǎn)：脫水完全，細(xì)胞內(nèi)不易形成冰晶缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)，需要特殊儀器第46頁，共98頁。

2、快速冷凍，快速解凍胚胎采集洗滌加1.4mol/L甘油中平衡20′裝管0℃平衡10′以1℃/分降至-6-7℃并平衡10′以0.3-0.5℃/min降至-35－-38℃后投入液氮。投入37℃水中解凍1′，然后用0.20M蔗糖PBS液洗2次。第47頁，共98頁。第48頁，共98頁。

3、一步冷凍法

采用25%的甘油、丙二醇、乙二醇中的任何兩種保護(hù)劑組成高濃度的玻璃化液，分兩步移入低、高濃度的保護(hù)劑中，裝管并在4℃平衡10′然后投入液氮。（DMSO對(duì)胚胎的毒性很大）第49頁，共98頁。25℃→25%甘油13′→25%甘油、0.25M蔗糖10′→4℃25%甘油、25%丙二醇30″→液氮解凍：胚胎→25℃水溫→0.5mol/L蔗糖5′→保存液沖洗3-4→裝槍移植。第50頁，共98頁。二、體外受精(一)卵母細(xì)胞體外成熟1、采卵：剖腹、腹腔鏡、屠宰場(chǎng)

卵子分四類①形態(tài)正常，卵丘細(xì)胞致密②卵丘細(xì)胞部分脫落③卵丘細(xì)胞全部脫落：裸卵④卵子已退化第51頁，共98頁。2、未成熟卵子的培養(yǎng)⑴TCM-199+胎牛血清+丙酮酸，可加cAMP、血清、生長因子、生殖激素(FSH、17β-雌二醇，hCG)39℃5%CO2飽和濕度20-30h⑵M199+PMSG10/ml+hCG10/ml17β-雌二醇1mg/L10%豬卵泡液⑶10%FSC+半胱氨酸69mg/L第52頁，共98頁。培養(yǎng)成熟牛卵母細(xì)胞第53頁，共98頁。(二)精子體外獲能1、精子洗滌：多次離心2、精子獲能

BO液→咖啡因，肝素、BSA、鈣離子載體改良Tyrode→10mg/ml肝素第54頁，共98頁。(三)體外受精微滴：5-10個(gè)卵母細(xì)胞加0.64-1×106/ml精子39℃5%CO2氣體→Tyride18-24hBO6-8h第55頁，共98頁。第56頁，共98頁。

液滴示意圖第57頁，共98頁。卵母細(xì)胞質(zhì)成熟：細(xì)胞質(zhì)成熟較難鑒定，因此，通常只檢查細(xì)胞核的成熟。

卵母細(xì)胞核染色

制片：壓片。固定：固定液乙醇：乙酸＝3：1，24h染色：1％地衣紅，40％乙酸鏡檢：光學(xué)顯微鏡第58頁，共98頁。制片、固定、染色示意圖

第59頁，共98頁。(四)早期胚胎的體外發(fā)育培養(yǎng)許多動(dòng)物早期胚胎均存在‘‘體外發(fā)育阻滯’’現(xiàn)象。6%mg/L半胱氨酸5%CO2第60頁，共98頁。(五)精子顯微注射指采用顯微操作方法將處理后的精子核或完整的精子直接注入卵質(zhì)，完成受精過程。細(xì)胞流式分類器基本程序：①精子注射前處理：精子核。②借助顯微操作儀將核直接穿過透明帶和卵膜進(jìn)入卵質(zhì)中；③注射后的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)。第61頁，共98頁。胞質(zhì)內(nèi)授精（ICSI）第62頁，共98頁。帶下授精第63頁，共98頁。第三節(jié)胚胎顯微操作⒈顯微操作儀分割⒉徒手分割0.1-0.2%鏈霉蛋白酶軟化透明帶

一、胚胎分割第64頁，共98頁。胚胎分割第65頁，共98頁。第66頁，共98頁。二、細(xì)胞核移植單個(gè)卵裂球或體細(xì)胞核，移入去核的成熟卵母細(xì)胞中采用一定的方法激活卵母細(xì)胞，使供體核和受體核融合為重構(gòu)胚，經(jīng)移植后發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)?！岸嗬颉眃oly第67頁，共98頁。核移植的程序圖第68頁，共98頁。克隆技術(shù)路線圖第69頁，共98頁。第70頁，共98頁。“多莉”doly第71頁，共98頁。顯微注射儀第72頁，共98頁。顯微注射儀操作臂第73頁，共98頁。顯微注射儀操作臂第74頁，共98頁。顯微注射儀操作臂第75頁，共98頁。拉針儀第76頁，共98頁。煅燒儀第77頁，共98頁。磨針儀第78頁，共98頁。

核移植技術(shù)的操作過程⒈供體核的分離技術(shù)

a、胚細(xì)胞胚胎干細(xì)胞類胚胎干細(xì)胞b、體細(xì)胞第79頁，共98頁。⒉受體細(xì)胞的去核技術(shù)

a、受精卵：松弛素b、成熟卵母細(xì)胞⒊核卵重組技術(shù)：移入供體核⒋卵母細(xì)胞的激活與細(xì)胞融合⒌核移植胚的培養(yǎng)與移植或重復(fù)克隆技術(shù)。第80頁，共98頁。三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指將外源基因通過顯微操作，整合到某種動(dòng)物的基因組中，并使之在轉(zhuǎn)錄及翻譯的水平上得以表達(dá)，從而改變?cè)撐锓N的生物學(xué)特性。第81頁，共98頁。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備第82頁，共98頁。㈠轉(zhuǎn)基因的意義⒈提高家畜的經(jīng)濟(jì)性狀，⒉以家畜為畜主生產(chǎn)有用的生物活性物質(zhì)，⒊抗病育種，⒋利用轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)人類所需的器官。第83頁，共98頁。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備過程第84頁，共98頁。㈡基因?qū)敕椒?、顯微注射第85頁，共98頁。轉(zhuǎn)基因小鼠制備過程第86頁，共98頁。⒉逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法⒊胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法⒋精子載體法第87頁，共98頁。第88頁，共98頁。第四節(jié)性別控制技術(shù)㈠沉淀法X精子體積較大，沉淀快㈡梯度離心法X、Y精子DNA含量有差異的原理，X較Y大㈢電泳法X、Y精子表面所帶電荷的差異靠近正極X、負(fù)極Y

一、精子分離方法第89頁，共98頁。㈣H-Y抗原法抗H-Y的抗體處理精子，使Y精子失能㈤精子的柱層析分離法葡聚糖凝膠G-50第90頁，共98頁。X精子的DNA含量略多干Y精子⒈速度慢，⒉受胎率較低，⒊價(jià)格昂貴。㈥流式細(xì)胞分類器第91頁，共98頁。二、胚胎的性別控制㈠細(xì)胞遺傳學(xué)

核型分析㈡X染色體連鎖酶活力測(cè)定法

雌性胚胎X染色體連鎖酶的活性是雄性的兩倍。㈢H-Y抗原法第92頁，共98頁。⒈細(xì)胞毒性分析法

含有H-Y抗血清與補(bǔ)體的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，有H-Y抗原的