樹突狀細(xì)胞對細(xì)胞il-10和gf-

樹突狀細(xì)胞對細(xì)胞il-10和gf-

c型腫瘤的來源、形態(tài)和功能具有明顯的多樣性和異質(zhì)性，不僅能誘導(dǎo)t細(xì)胞的激活，而且在誘導(dǎo)中腸炎和外圍抵抗方面也發(fā)揮著非常重要的作用。DC的不同成熟狀態(tài)有著不同的功能。DC的成熟狀態(tài)不僅決定T細(xì)胞的激活程度,而且還決定T細(xì)胞的反應(yīng)類型。未成熟DC可誘導(dǎo)T細(xì)胞無能或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生,從而誘導(dǎo)免疫耐受。本研究旨在探討未成熟DC對T細(xì)胞功能的影響及其可能機(jī)制。1材料和方法1.1細(xì)胞因子和tgf-1的分子RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIZOL為美國Gibco公司產(chǎn)品。PCRMarker購自大連寶生物公司。細(xì)胞因子rrIL-2、rrIL-4、rrGM-CSF均為Sigma公司產(chǎn)品。兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體購自SantaCruz公司。乙酰膽堿受體(AChR)由本實(shí)驗(yàn)室提取。健康雄性Lewis大鼠,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。1.2ova負(fù)載的dc按本實(shí)驗(yàn)室已有方法培養(yǎng)DC。收集疏松黏附于培養(yǎng)板底的DC,第6天加入LPS的同時,未成熟組和成熟組分別加入50μg/ml的AChR或50μg/ml的OVA,置37℃、5%的CO2孵箱中,用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18h即得AChR負(fù)載的iDC(AChR+iDC)、AChR負(fù)載的mDC(AChR+mDC)和OVA負(fù)載的mDC(OVA+mDC)。充分洗滌后重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基,加入終質(zhì)量濃度為25μg/ml的絲裂霉素C,于37℃孵育30min滅活后,以RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×105/ml作為刺激細(xì)胞。1.3混合淋巴結(jié)反應(yīng)1.3.1u3000不同濃度的il-2擴(kuò)增t細(xì)胞尼龍毛柱法分離Lewis大鼠脾臟T細(xì)胞。取24孔培養(yǎng)板,每孔分別加入106T細(xì)胞,再加入105AChR負(fù)載的iDC或mDC刺激,用完全培養(yǎng)基調(diào)整終體積為1ml。置37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。第6天加入終濃度為100U/ml的IL-2擴(kuò)增T細(xì)胞。2周后,同前條件加入105AChR負(fù)載的iDC或mDC再次刺激。再次刺激后第3天加入終濃度為100U/ml的IL-2擴(kuò)增T細(xì)胞。再次刺激1周后,同條件加入105AChR負(fù)載的iDC或mDC行第3次刺激。第3次刺激后第3天加入終濃度為100U/ml的IL-2擴(kuò)增T細(xì)胞。1.3.2免疫活性測定取96孔培養(yǎng)板,每孔分別加入2×105AChR負(fù)載的DC重復(fù)刺激前的T細(xì)胞作反應(yīng)細(xì)胞(NT);再分別加2×104、1×104、5×103AChR負(fù)載的iDC或mDC作刺激細(xì)胞,終體積為200μl;每濃度設(shè)3個復(fù)孔。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。4d后每孔加入5mg/ml的MTT20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心棄上清,每孔加入DMSO100μl,測各孔490nm波長的光密度值(A490nm),結(jié)果以3孔均值表示。同前方法,反應(yīng)細(xì)胞改為AChR負(fù)載的iDC或mDC重復(fù)刺激3次后的T細(xì)胞(iDC-3T或mDC-3T),測定其對AChR負(fù)載的iDC或mDC的增殖活性。同前方法,刺激細(xì)胞改為OVA負(fù)載的mDC,測定AChR負(fù)載的iDC或mDC重復(fù)刺激3次后的T細(xì)胞對OVA負(fù)載的mDC刺激的增殖活性。1.4基于-actin的生物合成工藝收集AChR負(fù)載的iDC或mDC初次刺激前、初次刺激后和重復(fù)刺激3次后的各組T細(xì)胞,用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA。在逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的作用下,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。然后通過PCR擴(kuò)增IL-12p35和參照β-actin的cDNA。IL-10的上游引物為:5′-AGGGCTGCCTTCAGTC-3′,下游引物為:5′-TGGAGAGAGGTACAAACG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為499bp。β-actin的上游引物為:5′-AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA-3′,下游引物為:5′-ATGCTGCTTACATGTCTCGAT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為266bp。PCR總反應(yīng)體積50μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,48℃(β-actin為54℃)退火30s,72℃延伸45s,共進(jìn)行32個循環(huán),72℃加強(qiáng)延伸7min。將10μl擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳,紫外透射儀下觀察并攝像。1.5蛋白質(zhì)電泳檢測收集AChR負(fù)載的iDC或mDC初次刺激前、初次刺激后和重復(fù)刺激3次后的各組T細(xì)胞,提取蛋白質(zhì)并在595nm波長下進(jìn)行檢測蛋白濃度。制備SDS凝膠后進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。在SDS凝膠上進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移并進(jìn)行免疫檢測。1.6比較方法:最小顯著差數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,多個實(shí)驗(yàn)組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),兩兩比較采用最小顯著差(LSD)法。兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)。2結(jié)果2.1淋巴結(jié)移植的測定2.1.1t細(xì)胞增殖能力的檢測AChR+mDC初次和重復(fù)刺激均能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞增殖。而AChR+iDC初次和重復(fù)刺激均只引起較弱的T細(xì)胞增殖,重復(fù)刺激后T細(xì)胞增殖能力更低,見表1。2.1.2t細(xì)胞對acrt-mdc的增殖AChR+mDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細(xì)胞對AChR+iDC的刺激引起較弱的增殖反應(yīng),而AChR+iDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細(xì)胞對AChR+mDC的刺激不引起增殖。AChR+mDC和AChR+iDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細(xì)胞均能對無關(guān)抗原OVA負(fù)載的mDC的刺激產(chǎn)生明顯增殖,前者增殖反應(yīng)更強(qiáng),見表2。2.2acrt-icp初次和第3次重復(fù)刺激il-10morna的表達(dá)5組T細(xì)胞β-actinmRNA表達(dá)恒定,無明顯差異,表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠,結(jié)果具有可比性。AChR+mDC初次和第3次重復(fù)刺激后,IL-10mRNA的表達(dá)較刺激前無明顯變化,而AChR+iDC初次和第3次重復(fù)刺激后,IL-10mRNA的表達(dá)較刺激前均明顯增高,見圖1。2.3TGF-β1的表達(dá)AChR+mDC初次和第3次重復(fù)刺激后,TGF-β1的表達(dá)較刺激前無明顯變化,而AChR+iDC初次和第3次重復(fù)刺激后,TGF-β1的表達(dá)均顯著增高,重復(fù)刺激后TGF-β1的增高尤為明顯,見圖2。3調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的誘導(dǎo)DC不僅可激活T細(xì)胞免疫,同時也可誘導(dǎo)中樞和外周耐受。DC提呈抗原最終表現(xiàn)為免疫激活還是免疫耐受的決定因素目前尚不十分清楚。一種觀點(diǎn)認(rèn)為,機(jī)體內(nèi)存在不同的DC亞群,它們分別負(fù)責(zé)不同的功能,如髓樣DC激活免疫反應(yīng)而淋巴樣DC則誘導(dǎo)免疫耐受。但近來研究表明,DC亞群的功能并非一成不變的,如從人的前體細(xì)胞分化而來的DC,對不同的活化刺激物表現(xiàn)出不同的反應(yīng),而大鼠未成熟髓樣DC可誘導(dǎo)耐受。因此,這種一類細(xì)胞對應(yīng)一類免疫反應(yīng)的觀念受到了挑戰(zhàn),并提出了另外一種觀點(diǎn):DC的不同成熟狀態(tài)有著不同的功能。未成熟DC表面MHC、共刺激分子及其它輔助分子的表達(dá)水平較低,所以雖然它們具有很強(qiáng)的抗原攝取加工能力,但由于缺少第一和/或第二信號的刺激而不能活化T細(xì)胞,導(dǎo)致T細(xì)胞的無能或低反應(yīng)性,從而誘導(dǎo)抗原特異性耐受。未成熟DC可誘導(dǎo)T細(xì)胞無能并顯著延長移植物的存活時間?？乖?fù)載的未成熟DC可誘導(dǎo)1型糖尿病耐受。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),未成熟DC可誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞無能。受者T細(xì)胞與供者未成熟DC共同培養(yǎng)后,當(dāng)再用供者免疫源性DC刺激時,細(xì)胞因子的分泌明顯減少且T細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的低反應(yīng)性。本研究中,AChR負(fù)載的mDC初次和重復(fù)刺激均能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞增殖,而AChR負(fù)載的iDC初次和重復(fù)刺激均只引起微弱的T細(xì)胞增殖;當(dāng)這些經(jīng)AChR負(fù)載的iDC重復(fù)刺激3個循環(huán)后的T細(xì)胞再用AChR負(fù)載的mDC刺激時,也不能引起T細(xì)胞增殖;但當(dāng)用無關(guān)抗原OVA負(fù)載的mDC刺激時,則產(chǎn)生明顯的增殖反應(yīng)。提示未成熟DC可引起T細(xì)胞耐受,且這種耐受是抗原AChR特異性的。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)具有特殊表面標(biāo)志和細(xì)胞因子分泌模式并具有調(diào)節(jié)功能的一個T細(xì)胞群體,其抑制功能在外周耐受的維持中具有十分重要的作用。調(diào)節(jié)性T-1(Tr1)細(xì)胞不同于Th1/Th2細(xì)胞,它們產(chǎn)生大量的IL-10、中量的TGF-β、少量的IL-2但無IL-4。Tr1受到刺激后增殖能力很弱,但在體內(nèi)外均具有免疫抑制功能,這種免疫抑制功能主要通過細(xì)胞因子IL-10和TGF-β而發(fā)揮,細(xì)胞間的直接接觸也起重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生與DC的成熟狀態(tài)密切相關(guān),人類未成熟DC在體內(nèi)外均可通過誘導(dǎo)具有調(diào)節(jié)能力的非增殖性Tr樣細(xì)胞的分化引起外周耐