定量蛋白組學(xué)百替生物

定量蛋白組學(xué)1編輯ppt

從基因組學(xué)到蛋白質(zhì)組學(xué)

人類(lèi)邁入后基因組時(shí)代20世紀(jì)上半葉，以遺傳學(xué)為代表，以DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出而告捷；20世紀(jì)下半葉，以分子生物學(xué)為代表，以“中心法那么〞的問(wèn)世，DNA重組技術(shù)誕生而集大成；20世紀(jì)90年代，“人類(lèi)基因組方案〔humangenomeproject，HGP〕〞的提出。2編輯ppt基因組方案的局限：

40～60%的基因編碼的蛋白質(zhì)的功能是未知的。基因組研究的局限性常規(guī)大規(guī)?；虮磉_(dá)檢測(cè)技術(shù)，無(wú)法精確反映蛋白質(zhì)的質(zhì)與量，組織中mRNA的豐度與蛋白質(zhì)的豐度并不完全一樣。因?yàn)榛虻降鞍踪|(zhì)存在三個(gè)層次的調(diào)控；蛋白質(zhì)復(fù)雜的后修飾無(wú)法從mRNA水平來(lái)判斷。3編輯ppt蛋白質(zhì)組學(xué)最早是由MarcWilkins在1995年提出的，源于蛋白〔Protein〕與基因組學(xué)〔Genomics〕兩個(gè)詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)〞，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。4編輯ppt對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜混合體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確鑒定和定量?？捎糜诤Y選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達(dá)蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)揭示細(xì)胞生理病理功能，同時(shí)也可對(duì)某些關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定性和定量分析定量蛋白質(zhì)組學(xué)(QuantitativeProteomics)5編輯ppt定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)Spectralcounts

InvitroInvivoPeakareaSILAC/15NICAT/iTRAQ6編輯ppt雙向電泳技術(shù)

〔Two-dimensionalelectrophoresis〕原理：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)〔pI)和分子量(Mr)不同而別離蛋白質(zhì)。第一向電泳：等電聚焦〔IsoelectricFocusing，IEF〕根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同將蛋白質(zhì)別離；第二向電泳：十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳〔SDS—PAGE〕利用蛋白質(zhì)的分子量大小不同將蛋白質(zhì)別離。7編輯ppt

雙向電泳流程基于2D的經(jīng)典定量分析方法。1、樣品準(zhǔn)備和定量：抽提對(duì)照組和各種不同實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)。2、蛋白質(zhì)別離：蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)2D別離后染色〔銀染、考染等〕。3、蛋白質(zhì)的定性與定量分析：通過(guò)與對(duì)照組相ImageMaster7.0分析出實(shí)驗(yàn)組中差異點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定差異點(diǎn)蛋白質(zhì),同時(shí)應(yīng)用軟件分析出其表達(dá)量的變化。8編輯ppt缺點(diǎn)：極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效別離。膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。敏感性和精確低9編輯ppt常見(jiàn)的同位素標(biāo)記技術(shù)化學(xué)標(biāo)記法：〔1〕ICAT法〔同位素親和標(biāo)簽技術(shù)，isotope-codedaffinitytags〕〔2〕iTRAQ法〔isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation〕代謝標(biāo)記法：〔1〕15N標(biāo)記法〔2〕細(xì)胞培養(yǎng)中含有穩(wěn)定同位素的氨基酸標(biāo)記法〔SILAC)10編輯ppt

ICAT試劑有三局部組成，有兩種形式，稱(chēng)為“重〞和“輕〞

重型〔含8個(gè)氘〕輕型〔不含氘〕。

第一親和標(biāo)簽〔生物素〕，用來(lái)別離經(jīng)標(biāo)記后的多肽；第二連接子，用來(lái)整合穩(wěn)定的同位素；第三活性基團(tuán)，用來(lái)特異結(jié)合巰基。同位素親和標(biāo)簽技術(shù)〔ICAT法，isotope-codedaffinitytags〕11編輯pptICAT標(biāo)記定量技術(shù)流程兩種蛋白質(zhì)分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑標(biāo)記標(biāo)記后等量混合，胰蛋白酶酶切親和純化得到ICAT標(biāo)記的多肽質(zhì)譜分析，依據(jù)MS質(zhì)譜峰圖強(qiáng)度進(jìn)行定量，MS/MS鑒定肽段12編輯pptICAT法的缺點(diǎn)〔1〕它不能用于標(biāo)記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質(zhì)?！?〕ICAT分子量相對(duì)較大〔約500Da〕與蛋白質(zhì)連接后可能會(huì)造成分子的空間位阻對(duì)小肽而言是一個(gè)較大的修飾物，會(huì)增加數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的復(fù)雜性13編輯ppt同重標(biāo)簽標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量

(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)14編輯pptiTRAQ試劑標(biāo)記原理報(bào)告局部：共有8種：質(zhì)量數(shù)分別為114~121Da，最多可同時(shí)標(biāo)記8組樣品。肽反響局部：能與肽鏈N端及賴(lài)氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接，從而將報(bào)告局部和平衡部位標(biāo)記到肽段上。平衡局部：質(zhì)量數(shù)分別為31~24Da，與報(bào)告局部相互配合，保證iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本的同一肽段具有相同的質(zhì)荷比。15編輯pptiTRAQ試劑是可與氨基〔包括氨基酸N端及賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基〕連接的胺標(biāo)記同重元素。在一級(jí)質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在一級(jí)質(zhì)譜中，不同來(lái)源的相同肽段表現(xiàn)為一個(gè)峰；在二級(jí)質(zhì)譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團(tuán)發(fā)生中性喪失，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異；同時(shí)，肽段的MS/MS結(jié)果結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可以鑒定出相應(yīng)的蛋白種類(lèi)。16編輯ppt17編輯pptiTRAQ實(shí)驗(yàn)流程1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質(zhì)；2：蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)復(fù)原，封閉后用胰蛋白酶酶切；3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標(biāo)記；4：等量混合各樣本中的標(biāo)記肽段；5：MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)及分析。18編輯pptiTRAQ技術(shù)優(yōu)勢(shì)靈敏度高：可檢測(cè)出低豐度蛋白；別離能力強(qiáng):可別離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等適用范圍廣：可以對(duì)任何類(lèi)型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，特別適用于采用多種處理方式或來(lái)自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析；結(jié)果可靠：定性與定量同步進(jìn)行，同時(shí)給出每一個(gè)組分的相對(duì)表達(dá)水平、分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；自動(dòng)化程度高：液質(zhì)連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，別離效果好。19編輯pptLabel-free指無(wú)標(biāo)簽標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，依賴(lài)于繁雜的信息分析完成定量過(guò)程，主要有兩種：信號(hào)強(qiáng)度法：根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜相關(guān)的肽段峰強(qiáng)度〔Massspectralpeakintensity〕、峰面積〔Peakarea〕、液相色譜保存時(shí)間〔LCretentiontime〕等信息進(jìn)行定量分析；譜圖計(jì)數(shù)法：根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜相關(guān)的每個(gè)蛋白鑒定到的肽段總次數(shù)〔Peptidehide或Spectralcounts〕、所鑒定肽段的離子價(jià)位〔Ioncountsofidentifiedpeptides〕等信息進(jìn)行定量分析。20編輯ppt將質(zhì)譜數(shù)據(jù)由譜峰形式轉(zhuǎn)化為直觀的類(lèi)似雙向凝膠的圖譜，譜圖上每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)肽段，再比較不同樣本相應(yīng)肽段的強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)經(jīng)行相對(duì)定量。21編輯ppt優(yōu)點(diǎn)：無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)與同位素標(biāo)記定量技術(shù)相比，實(shí)驗(yàn)本錢(qián)低，不需要購(gòu)置昂貴的同位素標(biāo)記試劑。缺點(diǎn)：不能將不同樣品同時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)操作比較繁瑣。需要更高的數(shù)據(jù)分析處理方法。22編輯ppt代謝標(biāo)記法—15N標(biāo)記法簡(jiǎn)介：在培養(yǎng)基中添加15N，細(xì)胞經(jīng)過(guò)假設(shè)干代培養(yǎng)后，蛋白質(zhì)將完全被同位素標(biāo)記，等量混合標(biāo)記與沒(méi)有標(biāo)記同位素的樣本、液相色譜和SDS別離，質(zhì)譜鑒定和定量。根據(jù)質(zhì)譜譜圖中成對(duì)峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據(jù)二級(jí)譜圖對(duì)肽段進(jìn)行序列測(cè)定從而鑒定蛋白質(zhì)。23編輯ppt優(yōu)點(diǎn)：高效性：15N標(biāo)記法是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)95%；重現(xiàn)性：降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異；靈活性：在培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記15N，操作方便。缺點(diǎn)：〔1〕只有蛋白質(zhì)的氨基酸序列，才可以對(duì)14N/15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽段的相應(yīng)質(zhì)量位移進(jìn)行預(yù)測(cè)?！?〕由于使用的15N培養(yǎng)基純度>96%，無(wú)法完全置換14N,所以15N標(biāo)記的肽段在質(zhì)譜中會(huì)有額外的同位素峰。24編輯pptSILAC即細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)原理是在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用于SILAC主要的穩(wěn)定同位素氨基酸是Lys和Arg,細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過(guò)程中同位素氨基酸將被細(xì)胞用于合成蛋白質(zhì)，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)5-6代后，細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)將被同位素標(biāo)記，等量混合標(biāo)記的蛋白質(zhì)后經(jīng)過(guò)SDS別離和質(zhì)譜分析，通過(guò)比較一級(jí)質(zhì)譜圖中三個(gè)同位素型肽段的面積大小進(jìn)行相對(duì)定量，同時(shí)二級(jí)譜圖對(duì)肽段進(jìn)行序列測(cè)定從而鑒定蛋白質(zhì)。25編輯ppt代謝標(biāo)記法—SILAC1、標(biāo)記：在缺乏Lys和Arg的培養(yǎng)基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成“中型〞或“重型〞；2、細(xì)胞處理，如藥物處理；3、細(xì)胞裂解、提取蛋白質(zhì)；4、等量混合對(duì)照與處理組蛋白質(zhì)、SDS電泳、染色；5、割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。26編輯pptSILAC相對(duì)于iCAT有著更高的精確性，而且不需要復(fù)雜的化學(xué)過(guò)程和純化步驟保證了樣品相似的實(shí)驗(yàn)條件。然而SILAC