超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定11種甾體激素殘留

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定11種甾體激素殘留

蛋白質(zhì)同化激素（aas）是一種具有環(huán)戊烷和多羥磷母核的激素藥物，主要是具有蛋白質(zhì)同化作用的雄性激素。它們能促進(jìn)畜禽生長(zhǎng),提高飼料轉(zhuǎn)化率,有利于蛋白質(zhì)的沉積,在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用。但蛋白同化激素在動(dòng)物食品中的殘留可能會(huì)危及消費(fèi)者的健康,具有潛在的致癌性。歐盟從1998年就禁止生長(zhǎng)激素用于食品動(dòng)物的飼養(yǎng),國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)、美國(guó)、日本等組織和國(guó)家對(duì)動(dòng)物食品中蛋白同化類激素的殘留都有嚴(yán)格的要求。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的第235號(hào)文件中規(guī)定丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、甲睪酮、群勃龍等在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量為不得在動(dòng)物性食品中檢出。因此,檢測(cè)可食性動(dòng)物源食品中蛋白同化類激素及其代謝產(chǎn)物殘留量是一項(xiàng)重要的指標(biāo)。動(dòng)物組織中蛋白同化激素類藥物的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)。其中GC-MS需要對(duì)蛋白同化激素進(jìn)行衍生,操作復(fù)雜,重現(xiàn)性差。LC-MS具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn),能夠?qū)?fù)雜基質(zhì)中的痕量組分進(jìn)行定性和定量分析。隨著各國(guó)對(duì)藥物殘留量要求的不斷提高和殘留檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步,采用液(氣)相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法已成為各國(guó)認(rèn)可的主要方法。通過對(duì)動(dòng)物源食品中AAS多殘留的提取、凈化及儀器分析方法的研究探討,本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)檢測(cè)豬、牛、羊及雞的肌肉組織與雞蛋中睪酮、甲基睪酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、司坦唑醇、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等10種蛋白同化激素類藥物和孕激素黃體酮?dú)埩袅康目焖俜椒ā?實(shí)驗(yàn)部分1.1藥物、藥物和試劑ACQUITYTM超高壓液相色譜儀和Micromass-QuattroPremier質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)。睪酮(testosterone)、甲基睪酮(methyltestosterone)、黃體酮(progesterone)、群勃龍(trenbolone)、勃地龍(boldenone)、諾龍(nandrolone)、美雄酮(大力補(bǔ),methandienone)、司坦唑醇(康力龍,stanozolol)、丙酸諾龍(nandrolonepropionate)及丙酸睪酮(testosteronepropionate)對(duì)照品購自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;苯丙酸諾龍(nadrolonephenylpropionate)對(duì)照品購自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。叔丁基甲醚、乙腈、甲醇均為色譜純(德國(guó)Merck公司);甲酸和碳酸鈉均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠);水為超純水。1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取適量的睪酮、甲基睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、司坦唑醇、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍,用甲醇分別配制成1g/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液及10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,冰箱中保存,備用。1.3-質(zhì)量分析的質(zhì)量分析條件1.3.1萃取條件及流速ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm)。流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈溶液;梯度洗脫程序:0→5.0min,50%B→90%B;5.0→7.0min,90%B;7.0→7.5min,90%B→50%B;7.5→10.0min,50%B;流速:0.3mL/min。柱溫:室溫。進(jìn)樣體積:10μL。1.3.2方法2:正離子模式離子源:電噴霧離子源(ESI),電壓3200V,溫度300℃。掃描方式:正離子模式。檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。脫溶劑氣、錐孔氣均為高純氮?dú)?流速分別為600,20L/h;碰撞氣為高純氬氣,壓力為0.36Pa(3.6×10-3mbar)。錐孔電壓、碰撞能量及定性離子對(duì)、定量離子對(duì)等參數(shù)見表1。1.4樣品制備稱取約500g豬、牛、羊或雞肌肉組織,切碎后勻漿備用;取10枚鮮雞蛋,去殼,均質(zhì)備用。1.5離心液提取法稱取5g均質(zhì)試樣(精確至0.01g),置于50mL離心管中,加入叔丁基甲醚25mL,于10000r/min均質(zhì)30s,振蕩10min;于4℃、6000r/min條件下離心10min,上清液轉(zhuǎn)移至100mL梨形瓶中,殘?jiān)性偌尤?0mL叔丁基甲醚振蕩提取一次。合并離心后的上清液,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45℃水浴中蒸發(fā)至干。加入流動(dòng)相A與B(體積比為1∶1)混合溶液2.0mL,超聲溶解殘?jiān)?于-20℃冰箱中放置30min,取適量溶液于16000r/min下離心5min,上清液過0.22μm針頭濾膜,濾液供測(cè)定。1.6標(biāo)準(zhǔn)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液配制空白試樣按照“1.5”節(jié)方法處理,取適量空白上清液加入不同量的蛋白同化激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制成1,2,4,10,20及100μg/L的基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液,混勻后進(jìn)樣。以待測(cè)物色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo),相應(yīng)待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得直線回歸方程。1.7加標(biāo)回收率的測(cè)定添加質(zhì)量濃度為50,100,500μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.1mL,制得1,2,10μg/kg添加水平的樣品,按上述方法處理,測(cè)定回收率。1.8檢出限和定量限取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,制得0.2,0.3,0.4,0.5μg/kg添加水平的樣品,按“1.5”節(jié)所述方法處理,以最低檢出濃度計(jì)算,3倍信噪比為檢出限,10倍信噪比為定量限。2結(jié)果與討論2.1式采集信號(hào)對(duì)于動(dòng)物肌肉組織和鮮雞蛋中多種甾體激素的分析,采用串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式采集信號(hào)。在ESI+電離方式下,11種甾體激素都可形成穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,然后進(jìn)行相應(yīng)的子離子全掃描,以確定MRM特征診斷離子,11種甾體激素選擇的特征離子見表1,每種藥物選擇兩個(gè)離子對(duì)。2.2不同激素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜行為基于超高效液相色譜分離的特點(diǎn)和要求,在優(yōu)化的流動(dòng)相條件下,11種甾體激素藥物在10min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的分離,峰形對(duì)稱,不拖尾,圖1為11種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM離子流色譜圖。比較了乙酸銨緩沖溶液或甲酸水溶液(A相)與甲醇或乙腈(B相)組成對(duì)分離的影響。在正離子模式下,乙酸銨緩沖液與甲醇或乙腈有機(jī)溶劑在UPLC分離系統(tǒng)中,11種藥物的色譜行為不理想;而在甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)體系,采用梯度洗脫,可實(shí)現(xiàn)11種甾體激素藥物的快速分離,且峰形良好。2.3快速前處理?xiàng)l件的確定比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚等溶劑或其混合物的提取效果,發(fā)現(xiàn)用叔丁基甲醚提取的回收率高而且易于濃縮,故以此為提取溶劑。在獸藥殘留分析中,SPE是目前最為快速、有效的凈化手段之一?？紤]甾體激素類藥物主要為由碳、氫及氧組成的中性化合物,極性較小,故進(jìn)行了正相的氧化鋁柱、氨基柱及反相C18柱的凈化試驗(yàn),但都不能有效地去除干擾,且降低了回收率。由于LC-MS本身具有較強(qiáng)的抗干擾能力,故本方法采用低溫脫脂凈化的快速前處理方法,對(duì)豬、牛、羊和雞肌肉組織及鮮雞蛋等動(dòng)物源基質(zhì)進(jìn)行了方法學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)表明,就5種動(dòng)物源食品基質(zhì)而言,豬與牛的肌肉組織一般脂肪含量相對(duì)較少,空白試樣的MRM離子流色譜圖中背景信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)較低;羊肌肉組織脂肪較多,采取低溫凝固處理后再緩慢解凍,取上清液過膜測(cè)定,可顯著減少背景信號(hào)的強(qiáng)度;雞肌肉組織空白試樣的MRM離子流色譜圖與羊肉組織背景信號(hào)強(qiáng)度類似,但在睪酮處有明顯的色譜峰,應(yīng)該為內(nèi)源性睪酮,含量低于1μg/kg;鮮雞蛋通過在堿性條件下用叔丁基甲醚沉淀蛋白,效果理想,進(jìn)一步低溫脫脂凈化后,可獲得背景信號(hào)較低的MRM離子流色譜圖,在滿足檢測(cè)要求的條件下,還可減少定容體積,達(dá)到更低的檢出限。典型的MRM提取離子流色譜圖如圖2所示,各通道均為提取的相應(yīng)藥物的定量離子流色譜圖。2.4哌體激素藥物的線性在1至100μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),睪酮、甲基睪酮、黃體酮、群勃龍、勃地龍、諾龍、美雄酮、司坦唑醇、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍等11種甾體激素藥物的線性良好,相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。采用空白樣品添加低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,按方法規(guī)定進(jìn)行前處理,然后上機(jī)測(cè)定,以3倍信噪比作為檢出限,10倍信噪比作為定量限,豬、牛、羊及雞肌肉組織和鮮雞蛋中睪酮、甲基睪酮、勃地龍、美雄酮及司坦唑醇檢出限為0.3μg/kg,群勃龍、諾龍、黃體酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮及苯丙酸諾龍檢出限為0.4μg/kg,定量限均為1.0μg/kg(見表2)。2.5回收率及精密度為消除或減少基質(zhì)效應(yīng)的影響,采用相應(yīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液?jiǎn)吸c(diǎn)校正法計(jì)算回收率。11種甾體激素類藥物在1,2及10μg/kg添加水平時(shí),豬、牛、羊及雞肌肉組織和鮮雞蛋中睪酮、甲基睪酮、勃地龍、美雄酮及司坦唑醇的回收率為62.3%～105%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～15%。17位碳上的—OH被酯化后的諾龍丙酸酯和苯丙酸酯、睪酮丙酸酯及17位碳上無—OH(被乙?；〈?的黃體酮,因脂溶性大大增加,在冷凍離心脫脂過程中損失較大,因而回收率整體偏低,但大于50%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于16%(見表3)。3