海狗油對實驗性脂肪肝的抑制作用

海狗油對實驗性脂肪肝的抑制作用

海狗油含有20碳5烯酸（epa）、22碳5烯酸（dpa）和22碳6烯酸（da）-3脂肪酸。這是人類必須的脂肪酸。它會抑制生長四烯酸（aa、-6.00）的代謝，并在各種組織的官僚機構(gòu)中代謝相應的前列腺素（pgs）、丙基二醇（mda）、血糖素（txs）、前列環(huán)素（pgi）和白三烯（lts）。它被稱為20噸類丙烯酸鈉（eit），具有抗血小板聚集、血管擴張和抗炎免疫等作用。本文從海狗油對肝脂和肝內(nèi)血栓素A2代謝產(chǎn)物及脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物MDA的影響等方面,探討海狗油對實驗性脂肪肝病的作用機理。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器海狗油有效成份EPA、DPA和DHA的含量大于25%,由本實驗室精制純化;辛伐他汀(simvastatin)50mg/片腸溶衣片,杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)放免藥盒,中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所;MDA、游離脂肪酸(FFA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒,北京幫定泰克生物技術(shù)有限公司;總膽固醇(TC)、肝油三酯(TG)檢測試劑盒,北京中生生物工程高技術(shù)公司。1.2動物合格號Wistar大鼠,SPF級,體重130～150g,♂,動物合格證號:京動許字(2000)第017號,由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供。動物實驗室為二級。1.3藥代動力學—儀器日立U-3310紫外可見分光光度計;BECKMANGS-15R低溫離心機;OLYMPUS-BX51生物顯微鏡;SN-695B智能放免γ測量儀,上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。1.4高脂飼料的飼料除10只大鼠作為空白組(始終喂基礎飼料)外,其余大鼠于試驗d1后肢內(nèi)側(cè)皮下一次性注射40%四氯化碳的橄欖油溶液3ml·kg-1,并飼以高脂飼料(脂肪20%,膽固醇1%,脫氧膽酸鈉0.2%,丙硫氧嘧啶0.2%,基礎飼料78.6%)。7周后,脂肪肝大鼠(解剖2只大鼠,病理檢查模型成立)按體重隨機分為模型組、辛伐他汀4mg·kg-1·d-1組、海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組,每組10只,每組分別ig等體積橄欖油、辛伐他汀4mg·kg-1·d-1、海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1,連續(xù)8周。1.5mda及sod活力測定最后一次給藥后大鼠隔夜禁食,股動脈放血處死取血,分離血清,按試劑盒要求,MDA用硫代巴比妥酸(TBA)比色法、SOD用黃嘌呤氧化酶法,測定MDA含量及SOD活力。1.6肝組織病理學檢測大鼠處死后迅速剖腹取肝,用濾紙濾干血水,每只取相同部位肝組織100mg,4℃下制備2%異丙醇的肝均漿液,3000r·min-1離心15min,取上清液按說明書要求測定TC、TG、MDA。同法取肝組織200mg,4℃下制備10%的生理鹽水肝勻漿液,離心取上清液按說明書要求測定SOD和FFA(酶比色法);另取上清液0.5ml,負壓吹干,臨測時加0.5ml生理鹽水復溶,按試劑盒要求,用放免法測定6-keto-PGF1α和TXB2。1.7cyp2e1免疫組織化學染色肉眼觀察肝臟后,取肝左葉一半迅速制作冰凍切片、蘇丹Ⅲ染色。另一半肝組織常規(guī)石臘包埋切片,CYP2E1免疫組織化學染色,于光學顯微鏡下觀察結(jié)果,并以生物圖像分析系統(tǒng)軟件(北京清大德人科技有限公司)處理顯色結(jié)果進行定量分析,以顯色指數(shù)表示。1.8統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較用t檢驗,各指標之間的相關(guān)性采用兩因素的相關(guān)分析。2結(jié)果2.1對tc、tg和ffa含量的影響模型組大鼠肝臟的TC、TG和FFA含量較空白組增加(P<0.01),而海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組TC、TG和FFA含量較模型組均有顯著降低(P<0.01),與辛伐他汀組相近(P>0.05);比模型組TC降低67%～87%、TG降低24%～51%、FFA降低1%～24%,表明海狗油減輕了肝臟的脂變程度(表1)。2.2不同處理對海狗油營養(yǎng)成分的影響脂肪肝模型組比空白組大鼠肝臟的6-keto-PGF1α/TXB2比值降低94%(P<0.01),而海狗油4.8g·kg-1組較模型組TXB2含量降低67%(P<0.01),6-keto-PGF1α含量升高174%(P<0.01),6-keto-PGF1α/TXB2比值增加713%(P<0.01,表2),即TXA2(不穩(wěn)定而水解為TXB2)含量降低,PGI(不穩(wěn)定氧化為6-keto-PGF1α)含量升高,表明TXA2抗血小板的粘附和聚集作用及PGI舒張血管的作用增加,提示海狗油與AA競爭抑制其代謝,使肝的血液流動性增加。2.3無砂混凝土面為0.0的情況模型組血清和肝臟的MDA比空白組均升高(P<0.01),SOD活力降低(P<0.01);海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組比模型組肝臟的MDA降低40%～83%(P<0.01),SOD活力升高35%～102%(P<0.01),表明海狗油有抗氧化、增強SOD活力的作用(表3)。2.4大鼠肝臟重、輕脂肪變性模型蘇丹Ⅲ染色與CYP2E1免疫組織化學染色結(jié)果相近:空白組大鼠蘇丹Ⅲ染色均為陰性,CYP2E1染色基本為陰性即肝臟無脂肪變性;模型組大鼠均為強陽性,出現(xiàn)肝細胞重度彌漫性脂肪變性;海狗油各劑量組和辛伐他汀組脂肝細胞數(shù)目減少。以生物圖像分析系統(tǒng)定量測定CYP2E1表達強度的顯色指數(shù),可清楚地看出模型組顯色指數(shù)最大,海狗油0.5、1.6和4.8g·kg-1·d-1組隨劑量增大顯色指數(shù)逐漸減小,CYP2E1表達受到抑制(圖1)。2.5-keto-pgf1與肝脂tc、tg、fps-nf1蛋白表達的相關(guān)性分析TXB2與肝TC、TG、FFA、CYP2E1表達的顯色指數(shù)、血清MDA和肝臟MDA呈正相關(guān),與血清SOD和肝臟SOD呈負相關(guān);而6-keto-PGF1α與肝脂TC、TG和FFA、CYP2E1表達的顯色指數(shù)、血清MDA和肝臟MDA之間呈負相關(guān),與血清SOD和肝臟SOD呈正相關(guān)(圖2)。這進一步提示海狗油具有抑制血小板聚集和舒張血管的作用,使肝內(nèi)血液流動增加,從而促進肝脂代謝,抗脂質(zhì)過氧化。3海狗油對肝臟脂代謝的影響文獻報道肝內(nèi)血液流動減慢,使肝竇狀腺阻塞是造成脂肪肝的原因之一。EPA(也稱為花生五烯酸)已被證實與AA競爭抑制其代謝過程,而抑制血小板聚集和舒張血管,使肝內(nèi)血液流動增加,但海狗油能否具有同效?本實驗證實中、高劑量海狗油使大鼠肝臟TXB2含量顯著降低,6-keto-PGF1α值顯著增加,即AA代謝產(chǎn)物TXA2降低,PGI增加,表明改善了微循環(huán),降低了血液粘度,使肝的血液流動性增加,從而間接降肝脂。大量氧自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生,直接損傷各種生物膜,氧化細胞膜的蛋白,導致肝細胞結(jié)構(gòu)與功能的損害,干擾肝內(nèi)脂代謝,MDA也是AA的代謝產(chǎn)物之一,而海狗油與AA競爭抑制其代謝過程。本實驗證實海狗油使CYP2E1表達下調(diào),肝細胞內(nèi)MDA濃度降低,SOD活性逐漸升高,有抗氧化作用,防止肝細胞的脂肪變性和肝臟損傷,促進肝內(nèi)脂代謝。文獻報道海狗油能提高肝臟脂代謝關(guān)鍵酶脂蛋白脂酶和低密度脂蛋白(LDL)受體的活性,促進脂代謝,抑制TG合成限速酶的活性,減少肝內(nèi)TG的合成,而直接降肝脂。本實驗證明海狗油可使肝內(nèi)TC、TG、FFA含量下降,減輕了肝臟脂變程度。本實驗從上述三個方面說明海狗油對脂肪肝抑制