燈盞花素對(duì)肝纖維化模型大鼠gf

燈盞花素對(duì)肝纖維化模型大鼠gf

燈盞花素是從燈豆花中提取的黃酮類，具有廣泛的生理活性。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell,HSC)與肝纖維化形成密切相關(guān)。在慢性損傷因素的持續(xù)作用下,肝內(nèi)分泌大量細(xì)胞因子,其中最主要的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β),它們?cè)诟谓M織內(nèi)沉積,使HSC活化,同時(shí)細(xì)胞的表型也向成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變,表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)。本文主要研究Bre對(duì)大鼠HSC分泌TGFβ1、α-SMA的干預(yù)作用,探討HSC抗肝纖維化作用的可能機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純系Wistar大鼠60只,雌、雄各半,2～3月齡,體重200～250g,由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1.1.2rt-pcr法Bre片(神威藥業(yè)有限公司);CCl4(鄭州化學(xué)試劑二廠);RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司);TGFβ1免疫組化試劑盒、α-SMA免疫組化試劑盒(武漢博士得生物工程有限公司產(chǎn)品)。1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化模型將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組(NOR)、模型組(MOD)、Bre低劑量組(DD)、中劑量組(DZ)、高劑量組(DG)、秋水仙堿組(COLC),每組10只,各組間暴露因素?zé)o差別(P>0.05)。用CC14腹腔注射法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,40%植物油溶液(1ml/kg),2次/w,共8w,同時(shí)用乙醇取代清水作為唯一水源。NOR組腹腔注射生理鹽水。于造模成功后(第8周末),Bre干預(yù)組給予燈Bre灌胃:濃度5、10、20mg/kg;COLC組按0.1mg/kg體重劑量灌胃,同時(shí)正常對(duì)照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。于第12周末處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,收集血清及肝臟標(biāo)本待檢。1.2.2肝組織-sma、tgf13(1)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase,AST)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。(2)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織α-SMA、TGFβ1:肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2去離子水,滅活內(nèi)源性酶。將切片浸入0.02mol/LpH7.2～7.6磷酸鹽緩沖液(PBS),微波爐加熱抗原修復(fù),后放置室溫自然冷卻30min。5%小牛血清(BSA)封閉液37℃孵育15min。滴加一抗,4℃過夜。滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。1.2.3pcr擴(kuò)增條件以合成的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用β-連環(huán)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參,上、下游引物分別為S:TGCCCATCTATGAGGGTTAC,A:CTGGAAGGTGGACAGTGAG,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為572bp,退火溫度為59℃。α-SMA上下游引物分別為S:5′-ACTGGTATTGTGCTGGACTC-3′,A:5′-TGCTGTTATAGGTGGTTTCG-3′,退火溫度為58℃,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為400bp;TGF-β1上下游引物分別為S:5′-TAATGGTGGACCGCAACAAC-3′,A:5′-GTGAGCACTGAAGCGAAAGC-3′,退火溫度為57℃,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為332bp。PCR反應(yīng)條件為94℃2min預(yù)變性,然后94℃30s,退火溫度30s,72℃90s,35個(gè)循環(huán),結(jié)束前72℃延伸10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液按4∶1混合,每孔道加8μl混合液,上樣后于電泳槽中電泳,電壓為80V,時(shí)間為40min,EB中染色15min,結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描,用目的基因區(qū)帶的灰度值與內(nèi)參β-actin區(qū)帶的灰度值之比為目的基因的表達(dá)水平。1.3統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,進(jìn)行方差分析、組間差異性檢驗(yàn)用q檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1alt和ast的比較MOD組大鼠血清ALT、AST明顯高于NOR組。與MOD組相比較,DZ組、DG組ALT、AST均明顯降低(P<0.05),DD組ALT降低(P<0.05),而AST無明顯差異。見表1。2.2各組大鼠血清中-sma、dg、tgf1顯色指數(shù)的比較NOR組α-SMA只表達(dá)于小動(dòng)脈及小靜脈,在膽管無表達(dá)。MOD組α-SMA主要表達(dá)于匯管區(qū)及纖維間隔,且呈長(zhǎng)橢圓形或梭形。與NOR組比較,MOD組α-SMA免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P<0.01)。COLC組、DZ組和DG組α-SMA顯色指數(shù)的表達(dá)較MOD組顯著下調(diào)(P<0.01),其中DZ、DG組與COLC組的α-SMA顯色指數(shù)的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。DD組α-SMA顯色指數(shù)與MOD組比較無明顯差異(P>0.05)。見表2。與NOR組比較,MOD組TGFβ1免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P<0.01)。COLC組、DG組和DZ組TGFβ1顯色指數(shù)的表達(dá)較MOD組顯著下調(diào)(P<0.01),其中DG組、DZ組與COLC組的TGFβ1顯色指數(shù)的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。DD組TGFβ1顯色指數(shù)與MOD組比較無明顯差異(P>0.05)。見表2。2.3rt-pcr結(jié)果2.3.1各組大鼠血清中-sma基因表達(dá)的比較MOD組與NOR組α-SMAmRNA有顯著性差異(P<0.01);不同劑量Bre作用于肝纖維化大鼠4w后,各劑量組和COLC組均能使α-SMAmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。三個(gè)劑量組之間α-SMAmRNA有顯著性差異(P<0.05);DG組與DD組之間α-SMAmRNA有非常顯著性差異(P<0.01);DD組與COLC組之間有顯著差異(P<0.05)。DG組、DZ組與COLC組之間差異不顯著無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3,圖1。2.3.2bre對(duì)肝纖維化大鼠tgf2mrna表達(dá)的影響mRNA表達(dá)的影響MOD組與NOR組TGFβ1mRNA有顯著性差異(P<0.01);不同劑量Bre作用于肝纖維化大鼠4w后,Bre不同劑量組和COLC組均能使TGFβ1mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01,P<0.05)。DD組與DZ組之間TGFβ1mRNA表達(dá)有顯著性差異(P<0.05);DD組、DG組與COLC組之間有顯著差異(P<0.05)。DZ與COLC組之間差異不顯著無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3,圖2。3對(duì)肝纖維化中-sma表達(dá)的調(diào)控肝纖維化發(fā)生、發(fā)展機(jī)理的研究認(rèn)為:HSC活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵?；罨疕SC的是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要來源。正常肝組織中只有血管和膽管平滑肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA,慢性肝病時(shí),前炎性細(xì)胞因子等誘導(dǎo)HSC活化、增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細(xì)胞表形,因此是否表達(dá)α-SMA可作為鑒別HSC是否激活的標(biāo)志,所以α-SMA作為HSC活化的主要標(biāo)志物,與HSC活化的程度及數(shù)量呈正相關(guān),抑制和減少HSCα-SMA的表達(dá),便可達(dá)到抑制其激活,抑止纖維化的作用。研究表明TGF-β是最強(qiáng)的肝纖維化促進(jìn)劑,HSC是TGF-β在纖維化進(jìn)程中最重要的來源,下調(diào)TGFβ1可通過誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生及其受體在HSC上的表達(dá);促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成并抑制其降解等方面抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DG組、DZ組可以保肝降酶,防治肝