中國藥科大學(xué)-色譜分析法概論(胡育筑)

色譜分析法概論分析化學(xué)教研室色譜分析法概論

1.概述2.色譜過程和術(shù)語3.色譜法開展趨勢概述1.色譜法〔chromatography)M.Tswett固定相：碳酸鈣；流動相：石油醚試樣混合物的別離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜別離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體〔氣體或液體〕，稱為流動相。概述利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的不同，在流動相流經(jīng)固定相時，由于各組分在兩相間的吸附、分配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移動，最終達(dá)到分離的目的。chroma

（色彩）graphy（圖譜）chromatography（色譜法）定義：概述別離根底：差速遷移概述功能：可分離性質(zhì)相似的物質(zhì)應(yīng)用：混合物的分離分析色譜法特點：概述20世紀(jì)初30-40年代50年代60年代柱色譜薄層色譜法（TLC），紙色譜法（PC）氣相色譜法（GC）氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）70年代80年代高效液相色譜（HPLC）超臨界流體色譜（SFC），毛細(xì)管電泳（CE）概述2.色譜法分類

a

兩相所處的狀態(tài)b分離機理c操作類型分類方法：〔1〕以兩相所處的狀態(tài)分類氣相色譜：流動相為氣體〔稱為載氣〕GC按固定相不同分為：氣固色譜(GSC)氣液色譜(GLC)液相色譜：流動相為液體，也稱為洗脫液或淋洗液。按固定相的不同分為：液固色譜(LSC)和液液色譜(LLC)。概述〔1〕以兩相所處的狀態(tài)分類流動相固定相類型液相色譜液固LS

色譜液液LL

色譜氣相色譜氣固GS色譜氣液GL

色譜(2)按操作形式柱色譜、平板色譜①柱色譜液-固吸附柱色譜法②平板色譜法〔薄層色譜、紙色譜〕

概述柱色譜(Columnchromatography

):HPLC,GCetc.平板色譜(Planarchromatography

):TLC,PC概述(3)按別離機理色譜法分離機理不同吸附色譜分子排阻色譜分配色譜離子交換色譜(3)按別離機理吸附色譜法〔absorptionchromatography〕

分配色譜法〔partitionchromatography〕離子交換色譜法〔ionexchangechromatography〕空間排阻色譜法〔又稱分子排阻色譜法〕〔sizeexclusionchromatography〕GLC┌─填充柱色譜法氣相色譜法─GSC(GC)└─毛細(xì)管柱色譜法經(jīng)典液相柱色譜法───LLC柱色譜法〔LC〕──LSC色譜法──IEC高效液相色譜法───SEC(HPLC)─LSC薄層色譜法(TLC)LLC液相色譜法平板色譜SEC(LC)紙色譜法〔PC〕└────毛細(xì)管電泳法(CE)超臨界流體色譜法(SFC)2.色譜過程和術(shù)語2.1色譜過程物質(zhì)分子在相對運動的兩相間，分配“平衡〞的過程。其別離機制是差速遷移。例：順反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸附……

2.2根本術(shù)語1.色譜⑴基線〔baseline〕：僅有流動相通過檢測器系統(tǒng)時產(chǎn)生的信號的曲線。如圖Ot線⑵峰高〔h〕：色譜峰頂點與基線之間的距離。如圖B’A線⑶峰寬標(biāo)準(zhǔn)差〔σ〕：兩拐點間距離之半。峰寬〔peakwidth,W或Y〕：通過色譜峰兩側(cè)的拐點作切線，在基線上的截距。如圖IJ間的距離色譜過程和術(shù)語半峰寬〔peakwidthathalfheight,W1/2或Y1/2〕：峰高一半處的峰寬。如圖GH間的距離W=4σ，W1/2=2.355σW=1.699W1/22.保存值試樣中各組分在固定相內(nèi)的滯留狀態(tài)，是主要的色譜定性參數(shù)。保存值通過實驗測定，用時間或相應(yīng)的流動相體積表示，稱為保存時間和保存體積。⑴保存時間tR〔min〕

⑵保存體積VR〔mL〕色譜過程和術(shù)語2.保存值⑴保存時間〔retentiontime,tR)：從進樣開始到某個組分的色譜峰頂點的時間間隔色譜過程和術(shù)語⑵死時間〔deadtime,t0orTM)：不被固定相滯留的組分〔流動相〕從進樣開始、通過色譜柱，到出現(xiàn)最大值所需要的時間。色譜過程和術(shù)語⑶調(diào)整保存時間〔adjustedretentiontime,t'R)組分由于和固定相作用，比不作用的組分在柱中多停留的時間色譜過程和術(shù)語2.保存值⑸死體積〔deadvolume,V0)由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間體積死體積大，色譜峰擴張，柱效降低⑹調(diào)整保存體積〔adjustedretentionvolume,V’R)由保存體積扣除死體積后的體積⑹調(diào)整保存體積VR‘：保存體積與死體積之差，其本質(zhì)為組分停留在固定相時所消耗流動相的體積與流動相流速無關(guān)和tR‘同屬于色譜定性參數(shù)即：

VR'

是定值，tR

'與FC成反比V0和

Vm、t0和

tm的區(qū)別由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間體積稱為V0；固定相充滿死體積所需的時間為t0

。平衡時流動相在色譜柱中占有的體積用Vm表示，經(jīng)過色譜柱所需時間用tm

表示。物理意義有區(qū)別Vm≤V0，tm≤t0。在多數(shù)情況下，可忽略導(dǎo)管和檢測器內(nèi)腔容的容積，視為近似相等。：指將待測物的保存行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保存行為(范圍內(nèi)組分的定性參數(shù))。

Ix:待測組分的保存指數(shù)，z與z+n為一對正構(gòu)烷烴的含C數(shù)，一般n為1。t’R(X)應(yīng)介于t’R(Z)和t’R(Z+n)之間。⑺保存指數(shù)Ix：色譜過程和術(shù)語⑴分配系數(shù)(partitioncoefficient，K

)

平衡時組分在固定相與流動相中的濃度比

與溫度有關(guān)3.分配系數(shù)和容量因子色譜過程和術(shù)語吸附系數(shù)adsorptioncoefficientKaKKsKpK分配系數(shù)partitioncoefficient滲透系數(shù)permeationcoefficient選擇系數(shù)selectivitycoefficient色譜過程和術(shù)語⑵容量因子〔capacityfactor，k)平衡狀態(tài)下，組分在固定相與流動相中的質(zhì)量之比k值與組分、固定相和流動相的性質(zhì)及溫度、壓力等有關(guān)——容量因子k與分配系數(shù)K的線性關(guān)系容量因子k

的計算

組分容量因子大，保存時間長——定性參數(shù)組分保存時間不等，容量因子也不等——別離根底色譜過程和術(shù)語k不同tR不同分離

k

與tR

關(guān)系色譜過程和術(shù)語4.別離參數(shù)別離因子α〔分配系數(shù)比、選擇性系數(shù)〕別離度〔resolution,Rs)色譜過程和術(shù)語別離度〔resolution,Rs)R=1.0基線別離R=1.5完全別離例1一個氣相色譜柱，由固定液的涂量及固定液在柱溫下的密度計算得Vs=14.1mL,載氣流速為43.75mL/min。別離一個含A、B、C三組分的樣品，測得組分保存時間組分A為1.41min、組分B為2.67min、組分C為4.18min、空氣為0.24min。試計算：〔1〕死體積〔假定檢測器及柱接頭等體積可忽略〕〔2〕各組分的調(diào)整保存時間和分配系數(shù)〔3〕相鄰組分的分配系數(shù)比α色譜過程和術(shù)語解：

色譜過程和術(shù)語檢測器及柱頭等體積可忽略時Vm≈V0

所以：

色譜過程和術(shù)語相鄰峰分配系數(shù)比為：

3.色譜別離的根本理論

3.1分配系數(shù)與保存行為的關(guān)系

在色譜柱(或板)一定時，Vs與Vm一定；假設(shè)流速、溫度也一定，t0一定,tR僅取決于分配系數(shù)K，K大的組分tR長。在實驗條件一定時，tR取決于組分性質(zhì)——定性指標(biāo)。色譜過程方程例：某色譜柱的Vs=1.3mL、V0=2.1mL，別離A、B兩物質(zhì)KA=10.0、KB=40.0。試計算A、B的保存體積。解：設(shè)V0=Vm，那么VR=V0(1+K·Vs/Vm)=V0+KVs，可得：VR(A)=15.1mLVR(A)B=54.1mL

3.2等溫線在一定條件下，組分在固定相和流動相間分配到達(dá)平衡時，在兩相中的濃度cs和cm的比值K為常數(shù)，由此繪制出的cs和cm的關(guān)系曲線顯然應(yīng)為一條直線，被稱為等溫線。線性等溫線為正常峰凸形等溫線，產(chǎn)生拖尾峰；凹形等溫線，產(chǎn)生前延峰

等溫線對其他色譜有指導(dǎo)意義⑴線性等溫線a〔理想〕→對稱峰⑵非線性等溫線①凸形b→拖尾峰②凹形c→前沿峰

一般使用對稱性因子(symmetryfactor)評價色譜峰的對稱性。對稱因子的計算式為

完全對稱(B=A)峰的對稱因子為1.00。對稱因子為0.95～1.05之間的峰看成為正常峰(對稱);B<A:T小于0.95的為前延峰；

B>A:T大于1.05的為拖尾峰。

中國藥典2005年版:拖尾因子速率理論------動力學(xué)等溫線塔板理論------熱力學(xué)色譜的根本原理3.3塔板理論

最早由Martin等人提出，把色譜柱比作一個精餾塔沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為引入理論塔板數(shù)(n)作為衡量柱效率的指標(biāo)〔1〕在柱內(nèi)一小段高度內(nèi)組分分配瞬間達(dá)平衡〔H→理論塔板高度〕〔2〕載氣非連續(xù)而是間歇式進入色譜柱，每次進氣一個塔板體積〔3〕樣品和載氣均加在第0號塔板上且忽略樣品沿柱方向的縱向擴散〔4〕分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)四個根本假設(shè)(把色譜柱看作一個分餾塔)設(shè)理論塔板數(shù)n——組分流過色譜柱時，在兩相間進行平衡分配的總次數(shù)理論塔板高度H——為使組分在柱內(nèi)兩相間到達(dá)一次分配平衡所需要的柱長3.3塔板理論3.3塔板理論色譜峰W

越小，n就越大，而H

就越小，柱效越高

n和H是描述柱效的指標(biāo)3.3塔板理論

由于死時間t0

包括在tR

中，而實際的t0不參與柱內(nèi)分配，所計算的n

值大，H小，但與實際柱效能不同；因此常把t0

扣除，采用有效理論塔板數(shù)n有效和有效塔板高H有效評價柱效能。

塔板理論優(yōu)缺點3.3塔板理論塔板理論的特點

⑴當(dāng)色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能那么越高，所得色譜峰越窄。⑵不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。塔板理論的局限性⑴柱效不能表示被別離組分的實際別離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法別離。⑵塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。vanDeemter

方程式3.4速率理論塔板理論優(yōu)缺點1.4.3速率理論3.4速率理論

1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter

等在研究氣液色譜時提出色譜過程動力學(xué)理論應(yīng)用了塔板理論板高H

的概念充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程從動力學(xué)角度較好地解釋了影響柱效的因素vanDeemter

方程的數(shù)學(xué)簡化式為：B/u縱向擴散項3.4速率理論式中u為流動相的線速度：A，B，C為常數(shù)A渦流擴散系數(shù)；B縱向擴散系數(shù)；C傳質(zhì)阻抗系數(shù)C?u傳質(zhì)阻抗項A渦流擴散項H3.4速率理論C?u傳質(zhì)阻抗項B/u縱向擴散項A渦流擴散項H渦流擴散項〔多徑擴散項〕：A產(chǎn)生原因：載氣攜樣品進柱，遇到來自固定相顆粒的阻力→路徑不同→渦流擴散3.4速率理論動畫影響因素：填充柱〔2～5mm〕固定相顆粒越小，填充越均勻，A項越小討論：

空心毛細(xì)管柱〔0.1~0.5mm〕，A=0，較高n3.4速率理論縱向擴散項〔分子擴散項〕：B/u產(chǎn)生原因：

組分在固定相中被流動相推動向前、展開→濃度梯度→譜帶展寬3.4速率理論動畫B/u—縱向擴散項：由于流動相的擴散，溶質(zhì)沿著柱長方向，存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散,又稱分子擴散相,導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，別離變差。

B=2γDgγ：彎曲因子，填充柱色譜，<1Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)〔cm2·s-1〕

討論：①γ——與填充物有關(guān)的因子〔擴散阻礙因子〕空心柱γ=1填充柱γ<1

②縱向擴散與u成反比u大，B/u可忽略u小，不可忽略③Dg——組分在氣相中的擴散系數(shù)M載氣大，Dg小，如：N2M載氣小，Dg大，如：H2，He3.4速率理論影響因素：討論：

3.4速率理論——縱向擴散項B/u分子擴散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴散↑，

擴散系數(shù)：Dg和〔M載氣〕1/2成反比

高流速/低柱溫/大M載氣降低縱向擴散選用分子量較大的載氣選擇載氣原那么：兼顧分析時間和減小縱向擴散u較小時，選M較大的N2〔粘度大〕u較大時，選M較小的H2，He〔粘度小〕3.4速率理論——縱向擴散項B/u較低的柱溫控制較高線速度產(chǎn)生原因：樣品在氣液兩相間分配，樣品未及溶解就被帶走，從而造成峰擴張3.4速率理論——傳質(zhì)阻抗項C?u傳質(zhì)阻抗系數(shù)動畫討論：注：固定液應(yīng)完全覆蓋載體外表，不可以太薄，否那么k太小，柱子壽命也短。3.4速率理論—傳質(zhì)阻抗項C?u影響因素：3.4速率理論——柱效與流速H–u曲線與最正確流速：流速對B、C兩項相反的作用，對柱效的總影響使得存在著最正確流速值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最正確流速。3.4速率理論——柱效與流速最正確流速即式中H對u的一階導(dǎo)數(shù)的極小值綜合優(yōu)化1.被別離組分分子在色譜柱內(nèi)運行的多路徑、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間到達(dá)等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。2.通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。3.速率理論為色譜別離和操作條件的選擇提供了理論指導(dǎo)。說明了流速和柱溫對柱效及別離的影響。4.各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱