酶免疫組化實驗

酶免疫組化技術微生物與免疫學教研室實驗目的1、掌握免疫組化技術的基本原理。2、掌握檢測T細胞表面分子CD3的實驗原理及檢測方法。3、掌握SABC免疫放大技術原理。免疫組織化學技術（immunohistochemistrytechnique,IHCT）是指在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，借助可見的標記物，對抗原抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。

抗原抗體反應的特異性組織化學的可見性分類酶免疫組化技術熒光免疫組化技術親和免疫細胞組化技術免疫金（銀）細胞染色組化技術免疫標記電鏡技術雜交免疫細胞組化技術酶免疫組化技術酶免疫組化技術是直接以細胞或組織切片為抗原相，以酶聯(lián)免疫技術檢測抗原或抗體的存在與否或定位的一類酶免疫技術。本實驗以酶免疫組化技術檢測CD3為例。以親和素-生物素-過氧化物酶（ABC或SABC）技術檢測T淋巴細胞亞群為例驗證酶免疫組織化學技術檢測組織抗原的方法。酶免疫組化染色中常用的酶及顯示底物最常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP）常用的供氫體：

二氨基聯(lián)苯胺（DAB）—反應產(chǎn)物呈棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）—反應產(chǎn)物呈橘紅色4-氯-1-萘酚—反應產(chǎn)物呈灰藍色生物素-親和素放大技術是一種以生物素(biotin，B)和親和素(avidin，AV)具有的多級放大結(jié)合特性為基礎的實驗技術，它既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標記，與標記免疫技術的有機結(jié)合，極大提高了分析測定的靈敏度。特點：靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、適用性常見類型：BAB法和ABC法ABC法原理1、預先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標生物結(jié)合，形成可溶的親和素（或鏈霉親和素）-生物素-過氧化物酶復合物（ABC或SABC）。2、當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化二抗（間接法）相遇時，ABC（或SABC）中未飽和的親和素結(jié)合部位就可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原-抗體反應與ABC（或SABC）標記體系連成一體進行檢測。優(yōu)點一個親和素（A）有4個生物素結(jié)合位點，一個過氧化物酶可結(jié)合多個生物素分子，ABC法將親和素作為“橋”把生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶連接起來，形成一個網(wǎng)絡狀復合物，其中網(wǎng)絡了大量酶分子，因此應用于檢測體系時，極大提高酶在抗原-抗體反應中的濃度，提高檢測敏感性。實驗原理將分離得到的淋巴細胞制成涂片，加入的CD3單克隆抗體與待檢單個核細胞涂片作用。CD3陽性的細胞就會與CD3單克隆抗體特異性結(jié)合，再用生物素化抗鼠IgG檢測CD3單抗與待檢細胞結(jié)合的情況。最后加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶(ABC橋聯(lián)法)，與生物素化抗鼠IgG結(jié)合，酶遇到底物時，能催化底物產(chǎn)生有色不溶性產(chǎn)物。根據(jù)細胞被底物著色的情況可以判定CD3陰性和陽性的細胞，測定其陽性百分率。SABCB-山羊抗鼠IgG抗體鼠抗CD3單抗CD3T淋巴細胞間接ABC法：CD3——鼠抗CD3單抗——B-山羊抗鼠IgG抗體——SABC實驗器材與試劑1、5%BSA

2、抗CD3單克隆抗體3、生物素化羊抗鼠IgG(二抗)4、鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶(SABC)5、3,3,-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)6、0.0lmol/LpH7.2PBS7、淋巴細胞分離液8、丙酮9、玻片、吸水紙、顯微鏡等實驗步驟1、無菌采集靜脈血3ml/2人，注入盛有肝素的無菌試管中（肝素濃度為20U/ml全血），立即輕輕搖勻，使血液抗凝。2、用無菌吸管加入等體積即3ml的室溫PBS液，使血液等倍稀釋。3、取10ml試管2支，分別加入1.5ml淋巴細胞分