桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白bdorobp2基因的克隆及原核表達(dá)

桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白bdorobp2基因的克隆及原核表達(dá)

昆蟲的感知系統(tǒng)是一種高度獨(dú)特、極其敏感的化學(xué)檢測器。該系統(tǒng)能夠識別環(huán)境中特定的化學(xué)污染物，并在昆蟲飼料、飼料研究、產(chǎn)卵選擇等信息交換方面發(fā)揮重要作用。昆蟲觸角是其嗅覺系統(tǒng)的重要器官,而氣味結(jié)合蛋白(odorant-bindingproteins,OBPs)則是廣泛分布于昆蟲觸角感器淋巴液中的一種低分子量的水溶性蛋白,其生理功能一般解釋為能溶解并運(yùn)輸外界脂溶性分子,穿過觸角感器淋巴液到達(dá)嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的氣味受體,從而激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(Vogtetal.,1991;KimandSmith,2001)。昆蟲OBPs分子量一般為15~20kD,由120~150個(gè)氨基酸組成,其典型特征是在其二級序列中存在6個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)殘基以形成3對二硫鍵(Pelosietal.,2006),目前已在多種昆蟲中發(fā)現(xiàn),例如雙翅目的果蠅屬Drosophila(Yasukawaetal.,2010),直翅目的飛蝗Locustamigratoria(Banetal.,2003a)、膜翅目的中華蜜蜂Apisceranacerana(李紅亮等,2008,2013)以及鱗翅目的棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Zhangetal.,2011)等。昆蟲OBPs能夠與數(shù)量眾多、結(jié)構(gòu)迥異的植物源揮發(fā)物結(jié)合(Breeretal.,1990),這也為以該蛋白為基礎(chǔ),從植食性害蟲的重要寄主植物揮發(fā)物中篩選引誘成分,設(shè)計(jì)高效的嗅覺引誘劑提供了重要的理論依據(jù)。桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis又名東方果實(shí)蠅(orientalfruitfly),屬雙翅目(Diptera),實(shí)蠅科(Tephritidae),果實(shí)蠅屬BactroceraMacquart,是一類重要的檢疫性害蟲(謝琦和張潤杰,2005;Wanetal.,2011)。該蟲寄主范圍廣,據(jù)報(bào)道可以為害46科250多種水果,對香蕉、番石榴、芒果和柑橘等為害嚴(yán)重(黃素青和韓日疇,2005;鄭小萍等,2007),給我國水果產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上主要采取化學(xué)防治控制其危害,但化學(xué)農(nóng)藥不僅易污染水果和環(huán)境,且因其為害方式特殊(主要以成蟲產(chǎn)卵于果實(shí)果皮下,幼蟲潛居果瓤取食,有果皮的物理屏蔽)而難以奏效。由于植食性昆蟲對其嗜好寄主植物的氣味有明顯的選擇傾向(江麗容等,2010),而桔小實(shí)蠅對于多種寄主水果也具有較明顯的嗜好性。Siderhurst和Jang(2006)研究發(fā)現(xiàn),熱帶水果欖仁Terminaliacatappa果實(shí)的乙醇提取物對桔小實(shí)蠅雌成蟲具有較強(qiáng)吸引作用。張淑穎等(2007)研究表明芒果果肉揮發(fā)物對桔小實(shí)蠅兩性成蟲均能產(chǎn)生顯著的引誘效果。胡黎明等(2011)研究結(jié)果推測甜橙精油中的烯萜類、醇類和醛類化合物可能是甜橙精油引誘桔小實(shí)蠅的主要成分。因此我們可以根據(jù)桔小實(shí)蠅的主要寄主水果揮發(fā)物篩選和設(shè)計(jì)其嗅覺引誘劑,但由于揮發(fā)物成分種類復(fù)雜,如何篩選出合適的引誘劑配方成為制約桔小實(shí)蠅嗅覺引誘劑尤其是雌蟲引誘劑的瓶頸。如前所述,昆蟲OBPs是設(shè)計(jì)嗅覺引誘劑的良好靶標(biāo),所以有必要對其嗅覺氣味結(jié)合的生理功能進(jìn)行研究。目前對OBPs的體外生理功能的研究主要采用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn),如二化螟Chilosuppressalis的CsupGOBP2(Gongetal.,2009)、埃及伊蚊Aedesaegypti的AaegOBP22(Yangetal.,2011)、草地螟Loxostegesticticalis的LstiGOBP1(孫紅巖等,2011)、麥長管蚜Sitobionavenae的SaveOBP2和SaveOBP3(Zhongetal.,2012)以及甜菜夜蛾Spodopteraexigua的ABP2(張婷等,2012)等,為本實(shí)驗(yàn)研究桔小實(shí)蠅OBP2蛋白的體外生理功能提供了技術(shù)參考。而桔小實(shí)蠅嗅覺相關(guān)的分子生物學(xué)研究僅見其化學(xué)感受蛋白(Huetal.,2010)和氣味受體(Zhengetal.,2012),未見有關(guān)OBP的報(bào)道。本研究克隆、表達(dá)并且純化了桔小實(shí)蠅的氣味結(jié)合蛋白BdorOBP2,利用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定了BdorOBP2和7種專一性寄主植物揮發(fā)物主要成分的結(jié)合特征,為高效篩選基于寄主果實(shí)氣味的引誘成分,設(shè)計(jì)更有效的桔小實(shí)蠅嗅覺引誘劑提供技術(shù)和方法。1材料和方法1.1溫度和濕度桔小實(shí)蠅為本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工飼養(yǎng)的種群。飼養(yǎng)條件為:溫度26±1℃,相對濕度65%±5%,光周期12L∶12D。待其化蛹、羽化后,收集性成熟時(shí)期的雌蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2試劑和標(biāo)準(zhǔn)材料主要試劑及工具酶:總RNA提取試劑盒Trizol、RT-PCR系統(tǒng)、SYBRPremixExTaq熒光試劑,限制性酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶以及pMD18-T載體等分子生物學(xué)試劑均購自TaKaRa公司;IPTG、X-Gal、氨芐青霉素等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;質(zhì)粒微量抽提試劑盒、反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒和凝膠回收試劑盒等購自Axygen公司;感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;原核表達(dá)載體pET-32a購自Novagen公司;親和層析凝膠柱購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司;熒光探針N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)和各種氣味揮發(fā)性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品均購自于百靈威公司,純度都在97%以上;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。1.3總rna的提取取羽化后性成熟的桔小實(shí)蠅雌成蟲50頭,在冰上分別用鑷子取下其觸角、頭、胸、腹、足及翅,操作時(shí)盡量保持各部分的完整性,然后按照總RNA抽提試劑盒使用說明提取桔小實(shí)蠅上述不同組織中的總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測后,按照反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。1.4erpemier5.0引物根據(jù)GenBank中登錄的桔小實(shí)蠅BdorOBP全長(GenBank登錄號:EU564816),利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。為方便將目的片段亞克隆至其他載體上,在正反向引物BdOBP-F、BdOBP-R上分別設(shè)計(jì)了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)(表1下劃線)。另外設(shè)計(jì)熒光定量引物qBdOBP-F和qBdOBP-R,以及內(nèi)參基因引物BdActin-F和BdActin-R(表1),引物由上海生工公司合成。1.5pcr反應(yīng)條件以反轉(zhuǎn)錄酶合成的桔小實(shí)蠅cDNA第一鏈為模板,擴(kuò)增桔小實(shí)蠅OBP2,得到開放閱讀框(ORF)全長。PCR反應(yīng)總體積為20μL,10×緩沖液2μL,1.9μLMg2+(25mmol/L),正反引物各0.5μL(5μmol/L),dNTPs混合液1μL(5mmol/L),模板cDNA1μL,ddH2O12.9μL,Taq酶0.2μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性4min后,95℃變性45s,57℃退火45s,72℃延伸45s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并割膠純化,克隆至pMD18-T載體內(nèi)后,轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞,最后將鑒定的陽性克隆菌送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。1.6序列分析1.7熒光定量pcr檢測利用1.4節(jié)中設(shè)計(jì)的引物,以1.3節(jié)中提取的各組織cDNA為模板,于iCycleriQ5real-timePCR檢測系統(tǒng)上進(jìn)行操作,每一樣品重復(fù)3次。熒光定量PCR檢測的反應(yīng)體系(25μL)為:SYBRPremixExTaqTM(2×)12.5μL,正反向引物(10μmol/L)各0.5μL,cDNA1μL,ddH2O10.5μL。熒光定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃1min;94℃10s,50℃30s,72℃延伸40s,共45個(gè)循環(huán),最后以每10s上升0.5℃的速度從55℃到95℃記錄熔解曲線。根據(jù)2-ΔΔCt法(LivakandSchmittgen,2001)對所得的Ct值進(jìn)行計(jì)算,并使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。1.8重組質(zhì)粒pet-bcorobp2的構(gòu)建用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切1.5節(jié)中的PCR產(chǎn)物,酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,利用膠回收試劑盒回收目的片段,然后將該片段與經(jīng)過相同雙酶切的pET-32a載體連接,按照常規(guī)方法將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-BdorOBP2轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)。1.9sds-東南角蛋白表達(dá)純化挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素(50mg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1∶100(v/v)的比例轉(zhuǎn)接后,振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6左右時(shí),取1mL菌液作為陰性對照,再向原菌液加入IPTG至終濃度為1mmol/L,于30℃200r/min繼續(xù)培養(yǎng),每隔1h取出1mL菌液,以未誘導(dǎo)的菌液為陰性對照,用SDS檢測不同誘導(dǎo)時(shí)間桔小實(shí)蠅OBP2的表達(dá)效果。將400mL誘導(dǎo)好的大腸桿菌菌液8000r/min離心10min,棄上清,收集至50mL離心管中,加入5mL細(xì)菌裂解緩沖液(50mmol/LTris-HCl,pH8.0,2mmol/LEDTA,100mmol/LNaCl,0.5%TritonX-100)和100μL溶菌酶(100mg/mL)充分重新懸浮菌體后,裂解過夜,次日超聲破菌,高速離心后,分別取上清和沉淀用于表達(dá)形式的分析。在包涵體溶液中加入5mL包涵體裂解液(50mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA,100mmol/LNaCl,8mol/L尿素),吹打溶解1h,10000r/min離心后取上清。再用含有鎳NTA瓊脂糖親和層析柱純化目的蛋白,用不同濃度咪唑溶液洗脫后,收集的7管洗脫液各取10μL進(jìn)行SDS分析,檢測目的蛋白的純度及所在收集管的位置。然后將確定含有純桔小實(shí)蠅OBP2重組蛋白的洗脫液全部轉(zhuǎn)移于透析袋中,在500mL0.01mol/LPBS緩沖液(pH7.4,含7mol/L尿素),4℃逐次降低透析液濃度,進(jìn)行透析復(fù)性72h,期間更換新鮮的PBS緩沖液6次。最后將透析好的蛋白用Bradford法定量至1mmol/L后,轉(zhuǎn)移至1.5mLEppendorf管內(nèi),保存于-20℃冰箱備用。1.10熒光探針的制備在室溫條件下,使用1cm的石英比色皿,在RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先測定桔小實(shí)蠅OBP2與1-NPN的結(jié)合曲線。將1-NPN熒光配基配成10mmol/L母液并置于4℃避光保存。移取1μmol/L桔小實(shí)蠅OBP2溶液于石英比色皿中,逐次加入3μL的1mmol/L1-NPN溶液反應(yīng)2min后,在282nm波長下激發(fā),記錄熒光發(fā)射光譜及最大發(fā)射波長328nm處時(shí)的熒光值,根據(jù)Scatchard方程(Scatchard,1949)線性化光譜數(shù)據(jù)(1)(范成平等,2005):其中[Dt]和[D]分別表示總的和體系中游離的1-NPN濃度,[Pt]為桔小實(shí)蠅OBP2重組蛋白的濃度,K為1-NPN與桔小實(shí)蠅OBP2的結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。然后使用1-NPN作為熒光探針,利用競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)來研究候選配基與桔小實(shí)蠅OBP2重組蛋白的結(jié)合常數(shù)。將供試配基(溶于甲醇,濃度為10mmol/L)逐次加入到1-NPN與桔小實(shí)蠅OBP2混合液中,每次加入后反應(yīng)時(shí)間2min,記錄熒光值。根據(jù)公式(2)(Banetal.,2003b)計(jì)算候選配基結(jié)合常數(shù)KD:其中[IC50]為競爭配基能替換50%的1-NPN時(shí)的濃度,[1-NPN]為未結(jié)合1-NPN的濃度,K1-NPN為OBPs與1-NPN的結(jié)合常數(shù)。1.11異質(zhì)性檢測obp2基因表達(dá)量的方差分析將熒光定量所得數(shù)據(jù)用SPSS16.0進(jìn)行方差分析,采用Duncan式多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行比較,分析桔小實(shí)蠅成蟲不同組織中OBP2基因的表達(dá)量差異。2結(jié)果與分析2.1催化劑的信號肽預(yù)測根據(jù)GenBank中桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白OBP基因(GenBank登錄號:EU564816)設(shè)計(jì)引物,克隆得到桔小實(shí)蠅OBP2開放閱讀框全長,命名為BdorOBP2(GenBank登錄號為KC773766)。BdorOBP2可讀框及編碼蛋白序列如圖1所示。序列測定結(jié)果表明,BdorOBP2可讀框ORF全長447bp,編碼148個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量17.44kDa,等電點(diǎn)5.72,信號肽預(yù)測結(jié)果顯示BdorOBP2N-末端包含由起始位置開始的23個(gè)氨基酸組成的信號肽。該蛋白具有氣味結(jié)合蛋白的一些典型特征,如序列中含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸。2.2系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析2.3意識不強(qiáng)、頭、腹、足和嘴唇中檢出率的對比根據(jù)2-ΔΔCt相對定量法,以頭部中的表達(dá)量為基準(zhǔn),研究BdorOBP2在桔小實(shí)蠅不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明,桔小實(shí)蠅BdorOBP2在頭中相對表達(dá)量最高,在翅中相對表達(dá)量最低,是頭部的63%±6%。BdorOBP2在胸、腹、足和觸角中的相對表達(dá)量分別是頭部的93%±2%,81%±2%,99%±5%和86%±6%(圖4)。方差分析表明BdorOBP2在頭、胸和足3組織中的相對表達(dá)量顯著高于翅中的相對表達(dá)量。2.4g誘導(dǎo)的菌液和蛋白表達(dá)在IPTG濃度為1mmol/L,溫度為30℃,誘導(dǎo)時(shí)間為5h,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下表達(dá)BdorOBP2,產(chǎn)物用SDS電泳進(jìn)行鑒定后,結(jié)果如圖5(A)所示,泳道1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液,未檢測到目的蛋白;泳道2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液,在37kDa左右有特異性蛋白條帶,和推測的分子量大小一致,并且蛋白是以包涵體形式表達(dá)(圖5B),表明成功表達(dá)出了BdorOBP2。由于功能實(shí)驗(yàn)需要有一定純度的重組BdorOBP2,所以要對表達(dá)的蛋白進(jìn)行變性、純化和復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)先對包涵體進(jìn)行變性處理后,利用鎳NTA瓊脂糖凝膠柱先進(jìn)行親和層析純化,再進(jìn)行SDS分析,結(jié)果如圖5(C)所示。最后在4℃用7mol/L尿素逐次降低透析液濃度,對目的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性后,然后用Bradford法定量至1mmol/L,最后轉(zhuǎn)移至1.5mLEppendorf管內(nèi),并保存于-20℃冰箱備用。2.5熒光探針spe與1-nn的結(jié)合在282nm激發(fā)波長下,在1μmol/L重組BdorOBP2溶液中,逐次加入3μL1mmol/L的1-NPN溶液進(jìn)行熒光掃描,如圖6所示,熒光光譜的多項(xiàng)式擬合以及Scatchard方程(公式1)線性化擬合的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.9953和0.9927,BdorOBP2與1-NPN的結(jié)合常數(shù)為3.03μmol/L,表明1-NPN非常適合作為BdorOBP2與植物配基結(jié)合的競爭性熒光探針。通過熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定了7種桔小實(shí)蠅主要寄生水果揮發(fā)性物質(zhì)和BdorOBP2的結(jié)合能力。由結(jié)合曲線(圖7)和結(jié)合常數(shù)(表2)可以看出,該蛋白對于酯類和醛類有很強(qiáng)的結(jié)合能力,其中對反-2-己烯醛和β-紫羅蘭酮的結(jié)合能力最強(qiáng),結(jié)合常數(shù)分別為9.96和15.37μmol/L。此外這7種揮發(fā)性物質(zhì)均能將1-NPN從BdorOBP2的相對熒光值競爭至50%以下,尤其β-紫羅蘭酮能將相對熒光值競爭至10%以下。3重組bch-3.3日整理劑為主要加強(qiáng)后抗體的功能昆蟲氣味結(jié)合蛋白識別和結(jié)合外界氣味分子是昆蟲感受外界氣味分子的第一步生化反應(yīng),對昆蟲與外界進(jìn)行信息交流具有重要意義(Vogtetal.,1999)。本試驗(yàn)通過對桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白BdorOBP2序列分析表明,BdorOBP2呈弱酸性,預(yù)測分子量約為17.44kDa,序列中有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn),具有氣味結(jié)合蛋白的典型特征,并且N-末端包含一個(gè)23個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽,與報(bào)道的昆蟲氣味結(jié)合蛋白特征基本一致(Leal,2005;Pelosietal.,2005)。氣味結(jié)合蛋白OBPs是昆蟲專一性識別外界氣味物質(zhì)的特異性蛋白,而觸角作為昆蟲最主要的嗅覺感受器官(王桂榮等,2002;Zubkovetal.,2005),理論上OBPs應(yīng)該主要分布在觸角等嗅覺器官上。而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示氣味結(jié)合蛋白在桔小實(shí)蠅雌蟲各組織中均有表達(dá),且表達(dá)豐度差異不甚明顯。這與黃蜂Polistesominμlμs(Calvelloetal.,2005)、瓜實(shí)蠅Bactroceracucurbitae(申建梅等,2011)和岡比亞按蚊Anophelesgambiae(李正西和Zhou,2004)等某些OBP基因的表達(dá)非常類似,暗示了昆蟲的某些氣味結(jié)合蛋白不僅起到嗅覺作用,還可能參與了其他生理功能。Zhang等(2011,2012)的研究表明實(shí)蠅類昆蟲的下顎須和前、中、后足跗節(jié)上錐形感受器可能具有嗅覺感受的功能。而本實(shí)驗(yàn)中BdorOBP2在桔小實(shí)蠅頭和足中呈較高豐度表達(dá),這也暗示了該基因在其他非嗅覺組織中也具有生理作用。為了深入探討B(tài)dorOBP2的功能,本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化了重組BdorOBP2,由于在大多數(shù)情況下,較小的多肽標(biāo)簽對融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響很小,盡管有可能會影響蛋白質(zhì)的活性(WuandFilutowica,1999),但也取決于標(biāo)簽的位置和氨基酸的組成(Bucheretal.,2002),而信號肽的存在與否對BdorOBP2蛋白的三維結(jié)構(gòu)變化不大,N端沒有折疊到