全蝎蛋白藥效組分對(duì)bel7202細(xì)胞凋亡的影響

全蝎蛋白藥效組分對(duì)bel7202細(xì)胞凋亡的影響

所有蝎子都是動(dòng)物東方蝎子的干燥身體。這是一種常見(jiàn)的動(dòng)物性中藥（2005年的《中國(guó)藥典》）。最早出現(xiàn)在開(kāi)寶草本植物，療效準(zhǔn)確。但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中一直缺少與臨床療效對(duì)應(yīng)的品質(zhì)鑒定的科學(xué)指標(biāo)和方法。本文以中藥藥效組分理論為基礎(chǔ),結(jié)合全蝎攻毒散結(jié)的功效,通過(guò)對(duì)全蝎蛋白藥效組分的研究,初步確定了全蝎蛋白藥效組分對(duì)腫瘤細(xì)胞Bel7402的細(xì)胞毒和細(xì)胞周期抑制作用。1材料表面東亞鉗蝎藥材,購(gòu)于河北安國(guó)藥材市場(chǎng),由北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定。1.1全蟹蛋白的合成全蝎粉末,蒸餾水浸提4h,取上層淡黃色提取液,抽濾得淡黃色透明液體,重復(fù)試驗(yàn)直到硫酸銨鹽析試驗(yàn)呈陰性為止,濃縮,硫酸銨鹽析。純化后的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行冷凍干燥,最終獲得全蝎蛋白藥效組分。稱(chēng)取適量供試品,加不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液溶解,0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌。4℃保存?zhèn)溆谩?.2反滲純水試驗(yàn)二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus,德國(guó));USAMILLIPORE反滲純水儀;450型酶標(biāo)比色儀(BioRad,美國(guó));FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BeckonDickinson,美國(guó))等。1.3pi、rhodamin-1,4,3,4-特胎牛血清(杭州四季青公司);胰蛋白酶(Gibco公司);臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue),碘化丙錠(propidiumiodide,PI)(美國(guó)Sigma公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司);Rhodamin123(法國(guó)Biotium公司);羅丹明(SRB,美國(guó)Amresco公司);RNAaseA(上海生工科技有限公司)等。1.4細(xì)胞植物2方法2.1蝎子全效物質(zhì)的制備2.2腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)、毒性和生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株(Bel7402),培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI-1640。按照常規(guī)法培養(yǎng)細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后分傳至數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶。2.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Bel7402細(xì)胞,用0.25%胰酶與0.02%EDTA等量混合的消化液消化配成單細(xì)胞懸液,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)稀釋至細(xì)胞密度為1.3×105個(gè)/mL。取滅菌后的96孔板,細(xì)胞懸液搖勻后,每孔加入細(xì)胞懸液150μL。設(shè)空白對(duì)照組(加等體積生理鹽水)和6個(gè)質(zhì)量濃度的試驗(yàn)組,每組6個(gè)重復(fù)孔。加樣完畢后,將上述培養(yǎng)板置于含5%CO2及100%濕度的37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。2500r·min-1,離心15min,吸去有血清培養(yǎng)基,每孔加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基200μL。在Bel7402的培養(yǎng)板中每孔加入預(yù)冷的50%三氯乙酸(TCA)50μL(TCA最終濃度為10%),4℃冰箱中固定1h。倒掉固定液,小孔用去離子水洗5遍,甩干,空氣干燥。每孔加入50μL0.4%羅丹明(SRB)染色,室溫放置30min。未與蛋白結(jié)合的SRB用1%乙酸洗5次,空氣干燥。結(jié)合的SRB用10mmol·L-1100μL非緩沖Tris堿液(pH10.5)溶解。搖床振蕩混勻5min。在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長(zhǎng)570nm,參比波長(zhǎng)450nm,測(cè)定吸光度(A)。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,并按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)。2.2.3細(xì)胞pbs和rnaasea檢測(cè)細(xì)胞數(shù)同2.2.2項(xiàng),取滅菌后的6孔板,細(xì)胞懸液搖勻后,每孔加入細(xì)胞懸液1500μL。設(shè)空白對(duì)照組(加等體積生理鹽水)和5個(gè)濃度的試驗(yàn)組,每組3個(gè)重復(fù)孔。加樣完畢后,將上述培養(yǎng)板置于含5%CO2及100%濕度的37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。用0.25%胰酶與0.02%EDTA等量混合的消化液消化配成單細(xì)胞懸液,離心收集細(xì)胞,PBS洗1次,離心棄PBS,用剩余的PBS充分混勻細(xì)胞,加入-20℃預(yù)冷24h的70%乙醇,混勻,封口,4℃過(guò)夜。1000~1200r·min-1離心10min,棄去70%乙醇,每支管中加入2mLPBS,振蕩器清洗混勻,1000r·min-1離心5min。倒出PBS,每支管中加入200μLPBS,20μLRNAaseA(終濃度為50mg·L-1),振蕩器混勻,37℃消化40min。每支管加入碘化丙錠(propidiumiodidePI,終濃度為50mg·L-1),振蕩器混勻,冰箱避光放置4℃染色1h。用尼龍網(wǎng)過(guò)濾,上機(jī)測(cè)試。以直方圖(橫坐標(biāo)為DNA相對(duì)含量,縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù))表示測(cè)定結(jié)果。比較對(duì)照組和試驗(yàn)組細(xì)胞群體的比例,即可判斷藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響。2.2.4統(tǒng)計(jì)方法采用F,q,χ2檢驗(yàn),并做劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的直線回歸和相關(guān)分析(相關(guān)系數(shù)用t檢驗(yàn)),對(duì)數(shù)概率單位法求IC50。3結(jié)果3.1代謝能力下降全蝎蛋白藥效組分處理Bel7402細(xì)胞后,細(xì)胞代謝能力下降,細(xì)胞毒性明顯。全蝎蛋白藥效組分對(duì)Bel7402細(xì)胞的劑量效應(yīng)關(guān)系顯著(表1,相關(guān)系數(shù)為0.9125,IC50為241g·L-1)。3.2可減少bel492c細(xì)胞凋亡的藥物因素對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有凋亡,細(xì)胞生長(zhǎng)良好。流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)全蝎蛋白藥效組分處理的Bel7402細(xì)胞48h,Bel7402細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡所特有的亞G1峰,而且細(xì)胞凋亡率隨藥物劑量的增加而增高,說(shuō)明全蝎蛋白藥效組分對(duì)Bel7402細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡的作用(表2)。4體外試驗(yàn)結(jié)果在MTT法試驗(yàn)中,用MTT染色后測(cè)定吸光度A時(shí),蛋白質(zhì)成分會(huì)影響A,無(wú)法從A方面檢測(cè)全蝎蛋白藥效組分的抗腫瘤活性。但顯微鏡下觀察時(shí),從24h起,在高劑量的試驗(yàn)組就已經(jīng)發(fā)生了細(xì)胞凋亡,至48h時(shí)低劑量組的細(xì)胞也發(fā)生了凋亡,鏡下觀察全蝎蛋白藥效組分有抗腫瘤活性。因此,試驗(yàn)時(shí)采用MTT法的試驗(yàn)方法,但是將染色劑換成受蛋白質(zhì)影響較小的羅丹明染色劑,并且增加脫色步驟的方法進(jìn)行試驗(yàn),得到較好的試驗(yàn)結(jié)果,A與鏡下觀察的細(xì)胞凋亡程度相統(tǒng)一。本研究用全蝎蛋白藥效組分對(duì)腫瘤細(xì)胞Bel7402的體外試驗(yàn)研究表明,當(dāng)濃度在37g·L-1以上時(shí),對(duì)癌細(xì)胞有明顯抑殺作用且抑殺效果與劑量呈線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.9125,其IC50為241g·L-1,在一次給藥后48h內(nèi)有顯著的抑殺作用,說(shuō)明全蝎蛋白藥效組分在體外有穩(wěn)定抑殺癌細(xì)胞的特點(diǎn)。在流式細(xì)胞試驗(yàn)中,經(jīng)全蝎蛋白藥效組分處理Bel7402細(xì)胞48h后,細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡所特有的亞G1峰,而且細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加而增高,但細(xì)胞的增值率與藥物濃度無(wú)明顯差異。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)全蝎蛋白藥效組分含量高于9.25g·L-1時(shí),能顯著增加Bel7402細(xì)胞