干燥老齡茶葉中沒食子酸酯的提取

干燥老齡茶葉中沒食子酸酯的提取

表中的無花子茶素（ecgg）是茶葉中的主要生物活性成分。國外一些學(xué)者研究表明:具有抗氧化活性的EGCG能夠與癌細胞基底層粘蛋白受體(67-kDalamininreceptor,67LR)結(jié)合，從而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。因此，EGCG的提取和應(yīng)用已受到廣泛關(guān)注。鮮磨勻漿、負壓空化混懸組合技術(shù)工藝(以下簡稱組合工藝)用于植物有效成分的提取具有明顯的優(yōu)勢，可以大幅度地加速有效成分的溶出，提高有效成分的提取率，并且不改變成分的性質(zhì)，在植物有效成分提取中具有良好的應(yīng)用前景。同時，考慮到EGCG提取過程中存在著較快的氧化現(xiàn)象，本文擬通過新鮮老齡茶葉在組合工藝提取過程中降低勻漿液的pH、抑制高效酶活性以及控制勻漿液的溫度來阻止或者延緩EGCG的氧化，以確保提取過程中獲得高含量EGCG的提取效果。并與傳統(tǒng)的提取方法進行了對比。1實驗部分1.1提取裝置和試劑高效液相色譜儀，1580泵，1575型紫外檢測器，日本Jasco公司生產(chǎn);FSH-2型高速勻漿機，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠生產(chǎn);負壓空化混懸固液提取裝置，森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室自制。新鮮老齡茶葉2004年4月，采自浙江富陽茶園;對照品EGCG購自Sigma公司，含量98%;試劑中乙腈、乙酸乙酯、硫酸為色譜純，購于美國DimaTechnologyInc．公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純。1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1ecgg含量測定選定4種不同提取條件。條件1:常溫水勻漿提取及負壓空化混懸固液提取;條件2:常溫檸檬酸水勻漿提取及負壓空化混懸固液提取;條件3:新鮮老齡茶葉經(jīng)高溫殺青后，再用常溫水勻漿提取及負壓空化混懸固液提取;條件4:高溫水勻漿提取及負壓空化混懸固液提取。稱取20g新鮮老齡茶葉，以1:10固液比加入提取劑于高速勻漿機中，勻漿提取至葉片完全粉碎后，減壓過濾，得勻漿提取液及濾渣，濾渣再以1:10固液比加入提取劑于負壓空化混懸固液提取裝置中，進行負壓空化混懸固液提取，通氣量為1m3·h-1，負壓空化混懸固液提取20min，每隔5min取樣，HPLC檢測EGCG的含量。確定最佳空化提取時間，減壓過濾，得提取液及濾渣，負壓空化混懸固液提取重復(fù)操作3次。1.2.2老齡茶葉干燥處理本實驗對干燥老齡茶葉選定3種不同的傳統(tǒng)提取工藝。工藝1:常溫水滲漉提取;工藝2:50℃水浸提;工藝3:回流提取。分別將20g新鮮老齡茶葉按如下兩種方法進行干燥處理:方法1:自然風(fēng)干;方法2:40℃烘箱內(nèi)烘干;干燥后的老齡茶葉經(jīng)粉碎機進行粉碎，過60目篩，置于提取裝置中，按照上述3種工藝分別進行提取。本實驗所確定的所有工藝的提取溶劑用量均相同。1.3ecgg含量測定1.3.1檢測波長及流動相的確定色譜柱ODS-C18(250mm×4.6mm,5μm);檢測波長:280nm;流動相:乙腈—水—乙酸乙酯—硫酸(體積比80:11:2:0.18);流速1.0mL·min-1，柱溫為室溫;進樣量10μL。1.3.2對照品溶液的配制精密稱取對照品EGCG2.9mg于10mL容量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，得EGCG0.2842mg·mL-1的對照品儲備液，備用。精密吸取對照品儲備液0.5、1、1.5、2和2.5mL，分別置于5mL容量瓶中，流動相稀釋至刻度，制成不同濃度的對照品溶液。依次取10μL上述對照品溶液進樣，測定峰面積，重復(fù)3次，取平均值，繪制標準曲線，并計算回歸方程。結(jié)果表明，EGCG在0.02842～0.2842mg·mL-1之間呈良好的線性關(guān)系。這其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為:Y=14683154.941x-21671.933，R2=0.999，式中，Y-峰面積積分值;x-對照品濃度。2結(jié)果與分析2.1聯(lián)合技術(shù)的實驗結(jié)果2.1.1空化時間、空化提取次數(shù)對ecgg含量的影響上述4種新鮮老齡茶葉提取條件，經(jīng)預(yù)實驗研究，固液比1:10(以干重計，下同)，確定最佳勻漿提取時間為1min。新鮮老齡茶葉經(jīng)勻漿提取后，過濾，得濾渣，濾渣再以固液比1:10加入提取溶劑進行負壓空化混懸固液提取。在確定最佳的空化提取時間后，濾渣重復(fù)空化提取3次。EGCG含量與空化時間以及空化提取次數(shù)關(guān)系變化如圖1,2。由圖1可知:條件3隨負壓空化混懸固液提取時間的延長，EGCG含量表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，確定最佳負壓空化混懸固液提取時間為15min。其它3種條件隨空化提取時間的延長，EGCG含量均表現(xiàn)為下降趨勢，確定最佳負壓空化混懸固液提取時間為5min。由圖2可知:條件3所得到的提取液中EGCG含量最高為502.85mg，其它3種條件得到的提取液中EGCG含量均比較低;隨提取次數(shù)的增加，4種條件提取液中EGCG含量均表現(xiàn)為下降趨勢。條件3在提取第3次時，所得到的提取液中EGCG含量仍較高，其它3種條件在空化提取第2次及第3次時，得到的EGCG含量較少。2.1.2不同提取溫度對ecgg降解酶活性的影響四種提取條件均采用勻漿固液提取1次、負壓空化混懸固液提取2次，提取后合并總的提取液，HPLC檢測，EGCG總量對比結(jié)果如表1。由表1可知:條件3EGCG提取量最多，原因在于:經(jīng)過殺青后的新鮮老齡茶葉體系內(nèi)酶成分完全失活，提取過程中EGCG降解量較小，提取量最大，為502.85mg;條件4EGCG提取量其次，為414.26mg，說明提取溫度對提取量有顯著影響，溫度高體系的分子運動快，物質(zhì)擴散速度快，EGCG溶出速度增加，但由于該提取過程未經(jīng)殺酶處理，高溫使酶失活是有一定溫度和一定條件的，是一個緩慢過程，因此，在此過程中仍有EGCG降解現(xiàn)象;條件1EGCG提取量最少，為306.37mg，說明常溫提取時，未對EGCG降解酶進行抑制，活性得以保持，EGCG降解量最大;條件4較條件1EGCG提取量多，說明在此過程中檸檬酸的加入會對EGCG降解酶起到一定的抑制作用，但不同時期以及不同批次的新鮮老齡茶葉，EGCG降解酶含量是不同的，體系中酶的降解作用也不同的。由于實驗未對檸檬酸濃度進行細致挑選，檸檬酸的添加量不夠，表現(xiàn)為對EGCG降解酶的抑制作用有限，其適宜濃度及其它條件的確定，還有待于進一步研究。2.2提取法中ecgg含量由表2可知:滲漉法經(jīng)相同時間提取后，40℃烘干葉的提取液EGCG含量較高，為156.61mg;自然風(fēng)干葉的提取液EGCG含量較少，為139.96mg，后者為前者的89.4%。50℃浸提法經(jīng)相同時間、次數(shù)提取后，仍為40℃烘干葉的提取液EGCG含量較高，為179.35mg;自然風(fēng)干葉的提取液EGCG含量較最少，為146.83mg，后者為前者的81.87%。回流提取法經(jīng)相同時間、次數(shù)提取后，結(jié)果仍為40℃烘干葉的提取液中EGCG含量較高，為234.59mg;自然風(fēng)干葉的提取液EGCG含量較少，為130.54mg，后者為前者的55.56%。2.3最佳提取工藝的測定在本研究所確定的條件下，將最佳組合的提取工藝與傳統(tǒng)工藝中的最佳提取工藝進行對比(見表3)。由表3可知，組合工藝EGCG提取量比傳統(tǒng)工藝提取量明顯增多，提取量最多者為傳統(tǒng)工藝的2.14倍，并且提取時間大大縮短。3提取工藝的確定由表3可知，組合工藝與傳統(tǒng)工藝相比，具有較明顯的優(yōu)勢，一方面在時間上較短，大大地提高了工作效率，同時在EGCG提取量上也具有明顯優(yōu)勢。傳統(tǒng)工藝不僅浪費能源，同時對最終EGCG產(chǎn)品的質(zhì)量也有不利的影響。傳統(tǒng)工藝提取量較少，分析原因可能為:新鮮老齡茶葉于25～26℃自然風(fēng)干脫水過程時，體系內(nèi)環(huán)境較適合酶的生存，因此酶的作用時間長，造成EGCG降解嚴重，因此提取量低。而組合工藝能夠快速地進行細胞破壁，對有效成分進行快速地提取，同時不會改變有效成分的性質(zhì)，因此提取量較高。綜上所述，在本研究所確定的實驗條件內(nèi)，組合提取最佳工藝為:新鮮老齡茶葉高溫殺青后，常溫水勻漿萃取，固液比為1:10，勻漿萃取時