氣相色譜法測定瘤胃發(fā)酵液中的有機(jī)酸

氣相色譜法測定瘤胃發(fā)酵液中的有機(jī)酸

腫瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的液體脂肪酸（vf）是表面活性劑的重要來源，約占反芻動物吸收能量的70%80%，其中乙、丙、酸占腫瘤胃發(fā)酵vfs總數(shù)的95%。因此，對檢測反向芻動物腫瘤的分解非常重要。目前，檢測發(fā)芽脂肪酸的方法主要有色度法、柱色譜法、紙色譜法、滴定法和液相色譜法。在中國，不同材料的填充柱被用來檢測樣品中的vf含量，大多數(shù)是通過程序加熱和一些暖條件來實現(xiàn)的。在本研究中，通過對載氣、壓力、速度、柱溫、柱流量、氣化室溫度和安裝室內(nèi)溫度的一些鉻條件的探索，提出了一種快速測定腫瘤胃外生物中蒸發(fā)脂肪酸的方法。1設(shè)備和材料1.1氣相色譜儀美國熱電菲尼根(ThermoFinnigan)Trace-GC2000氣相色譜儀,氫火焰離子化檢測器,Chrom-Chard色譜工作站,并配有空氣壓縮機(jī)(1000-25B)、氫氣發(fā)生器(Parker)、氮氣發(fā)生器(Parker)、微量注射器.1.2柱流模式d色譜柱:HP-INNOWAX(19091N-133)毛細(xì)管柱(30cm×0.32mm×0.5μm),橫流模式,流量0.70mL/min,線速度35cm/min,柱壓90kPa;柱溫:恒溫模式(180℃);進(jìn)樣口:載氣高純氮氣,分流比40∶1,進(jìn)樣量0.67μL,溫度220℃;檢測器:FID,溫度250℃,氫氣流量40mL/min,空氣450mL/min.1.3標(biāo)準(zhǔn)液的配制按表1配置100mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液.在5個1.5mL離心管中加入0.2mL含有2-乙基丁酸(2EB)的偏磷酸去蛋白溶液,然后分別加入1、0.8、0.6、0.4、0.2mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,以及0、0.2、0.4、0.6、0.8mL蒸餾水,即配制成5級VFA梯度標(biāo)準(zhǔn)液(表2).1.4瘤胃管人工瘤胃養(yǎng)成液hf在瘤胃體外發(fā)酵系統(tǒng)(HGT)的100mL培養(yǎng)管內(nèi),準(zhǔn)確添加粉碎后經(jīng)40目篩(或0.5mm篩)的苜蓿干草粉200mg.在活塞前端1/3部位均勻涂抹凡士林,在39℃下預(yù)熱.試驗用瘤胃液取自2只裝有永久性瘺管的藏羊,體重為(30±10)kg,舍飼,自由采食苜蓿干草,自由飲水.在晨飼前用自制吸管經(jīng)瘤胃瘺管從瘤胃腹囊下部吸取瘤胃內(nèi)容物,迅速裝入預(yù)熱至39℃,且通入CO2的容器中,保溫(39℃)迅速帶回實驗室.混合均勻后經(jīng)4層紗布過濾,量取所需體積的瘤胃液加入至準(zhǔn)備好的人工瘤胃營養(yǎng)液中(瘤胃液與人工培養(yǎng)液的體積比為1∶2),制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液,用磁力攪拌器攪拌,同時通入無氧CO2.用自動移液器向培養(yǎng)管中加入人工瘤胃培養(yǎng)液30mL,排出培養(yǎng)器中的氣體,用夾子夾住前端硅橡膠管,記錄初始刻度(mL),將其置于已預(yù)熱的恒溫水浴箱(39℃)中體外發(fā)酵培養(yǎng).量取經(jīng)過一定時間發(fā)酵的瘤胃液5mL,加入1mL含有內(nèi)標(biāo)物2EB的25%偏磷酸溶液,4℃下高速離心(3000r/min),上清液置于冰箱中備用,測定發(fā)酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量.2結(jié)果與分析2.1色度條件的選擇2.1.1強極性物質(zhì)的表征瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)物乙、丙、丁酸為水相中存在的低分子有機(jī)酸,均為強極性物質(zhì),HP-INNOWAX柱是強極性的聚乙二醇(PEG)交鏈鍵合毛細(xì)管柱,可以承受水溶劑的樣品分離.因此,可采用HP-INNOWAX(19091N-133)毛細(xì)管柱進(jìn)行分析.2.1.2柱溫和柱壓對乙、丙、丁酸峰形的影響由于瘤胃液中的揮發(fā)酸主要是沸點較低的乙酸(118℃)、丙酸(141℃)和丁酸(163.5℃),且相互之間分子量差別不大,因此可直接上樣,進(jìn)行恒溫法分析.固定其他分析條件,分別在柱溫160、165、170、175、180、190℃和氮氣壓力80、85、90、100kPa條件下測定乙、丙、丁酸標(biāo)準(zhǔn)液.結(jié)果表明,柱溫在180℃,柱壓在90kPa時,乙、丙、丁酸峰形較好,且可以有效地進(jìn)行分離.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立在上述色譜條件下,采用保留時間對照法和標(biāo)準(zhǔn)追加物法,確定瘤胃發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸的保留時間.由標(biāo)準(zhǔn)色譜圖1可知,乙、丙、丁酸的峰形良好,出峰時間恰當(dāng),以上標(biāo)準(zhǔn)圖譜的3個峰分別是乙、丙、丁酸,其保留時間分別為3.12、3.56、4.24min.分別抽取0.67μL的5級梯度標(biāo)準(zhǔn)液,手動進(jìn)樣至氣相色譜FID進(jìn)樣口,據(jù)峰面積的出峰時間,確定它們在色譜柱上的保留時間,用峰面積法定量,根據(jù)濃度和峰面積的關(guān)系,建立線性回歸方程(表3).2.3酸相色譜法測定乙、丙酸和丁酸含量按表4配置不同濃度的乙酸、丙酸和丁酸溶液,用上述方法重復(fù)10次分別測定溶液中乙酸、丙酸和丁酸的含量,計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.從表2可知,乙酸、丙酸、丁酸的回收率在94.4%～96.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.23%～1.71%之間,說明采用氣相色譜法測定乙酸、丙酸和丁酸的含量,精確度和可信度均較高.2.4脂肪酸、丙酸、丁酸濃度的確定量取處理后的發(fā)酵液0.67μL進(jìn)樣,根據(jù)保留時間和峰面積,計算出發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸、丙酸、丁酸濃度,分別為(31.65±1.12)、(8.55±0.92)、(4.34±0.81)mmol/L.3高效液相衍生化酶關(guān)于氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸的方法有很多,但所用的色譜條件差別很大,通常采用不同材料的填充柱來檢測,大多采用程序升溫模式及甲酯衍生化處理.甲酯衍生化可改善被測樣品的揮發(fā)性和穩(wěn)定性,降低有機(jī)酸