項(xiàng)目名稱喬治王島地區(qū)低溫微生物物種和基因資源調(diào)查與功

陳波中國(guó)極地研究中心科技部基礎(chǔ)平臺(tái)條件項(xiàng)目子項(xiàng)目極地微生物菌種資源標(biāo)準(zhǔn)化整理整合科技部973計(jì)劃項(xiàng)目極端微生物及其功能利用的基礎(chǔ)研究子項(xiàng)目—極地極端微生物的生物多樣性及潛在應(yīng)用價(jià)值評(píng)估（本項(xiàng)目符合中國(guó)極地科學(xué)中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃的優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域）現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)行人：陳波中國(guó)極地研究中心（越冬考察）周明揚(yáng)山東大學(xué)生命科學(xué)院微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（越冬考察）考察背景：南極地區(qū)各類生境微生物推動(dòng)著陸地和海洋系統(tǒng)的氧、碳和其它必需元素的循環(huán)。它們長(zhǎng)期適應(yīng)極地極端寒冷和干燥、強(qiáng)烈輻射變化等特殊環(huán)境，在湖泊、海洋、沉積、土壤及其冰凍環(huán)境中形成了各種代謝水平和分子水平的適應(yīng)機(jī)制，同時(shí)存在與其他物種間的協(xié)同或拮抗等相互作用機(jī)制，其生存環(huán)境的特殊性和多樣性造就了他們經(jīng)過長(zhǎng)期適應(yīng)形成的豐富的物種多樣性、代謝多樣性和遺傳多樣性，并在生理/代謝適應(yīng)和代謝產(chǎn)物上表現(xiàn)獨(dú)特的多樣性。生活在南極特殊生境中的微生物蘊(yùn)涵著生命進(jìn)化歷程的豐富信息，代表著生命對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力，是生物遺傳和功能多樣性非常豐富的資源寶藏。喬治王島地區(qū)為地處南緯62°左右的島嶼地形，氣候條件相對(duì)南極大陸偏暖而降水豐富，動(dòng)植物區(qū)系比較豐富，過去若干年來零星的微生物學(xué)調(diào)查和分析表明該地區(qū)的土壤、植被和近岸海洋微生物多樣性較高，物種資源豐富是該地區(qū)的重要區(qū)系特征，本項(xiàng)目將結(jié)合我國(guó)極地科學(xué)中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃，綜合開展該地區(qū)湖泊、鳥類棲息地、植被土壤、潮間帶、近岸海洋沉積環(huán)境和海洋生物共附生環(huán)境等特殊生境的微生物多樣性、基因資源多樣性、產(chǎn)物多樣性方面開展系統(tǒng)調(diào)查并在系統(tǒng)生物活性方面開展功能評(píng)價(jià)和分析。南極低溫微生物資源的調(diào)查和研究多年以來一直是國(guó)際學(xué)術(shù)界高度關(guān)注的問題，也是ATCM體系在國(guó)際條法領(lǐng)域一直存在爭(zhēng)議的重要領(lǐng)域。由于南極微生物資源背后存在重大的經(jīng)濟(jì)利益、技術(shù)權(quán)益的競(jìng)爭(zhēng)，發(fā)達(dá)國(guó)家特別是其中的主要南極考察國(guó)家近年來加快了該領(lǐng)域的調(diào)查和技術(shù)投入。我國(guó)在該領(lǐng)域的發(fā)展時(shí)間不長(zhǎng)但認(rèn)知水平不斷提高，需要在資源、技術(shù)層面采取有效措施推動(dòng)我國(guó)的南極生物資源和生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展，為我國(guó)南極的科學(xué)、技術(shù)和外交權(quán)益服務(wù)?？疾靸?nèi)容（1）南極喬治王島地區(qū)湖泊環(huán)境微生物多樣性調(diào)查與宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建依托中國(guó)南極長(zhǎng)城站的實(shí)驗(yàn)室及其后勤支持系統(tǒng)，利用冬季湖泊結(jié)冰后以冰鉆開孔及夏季湖泊作業(yè)平臺(tái)（極地中心專門設(shè)計(jì)制作），開展法爾茲半島地區(qū)燕鵝湖、銀鏡湖、長(zhǎng)湖、團(tuán)結(jié)湖、格魯?？?、月牙湖等8-10個(gè)湖泊的水體和湖相沉積物樣品的采集，實(shí)施湖泊環(huán)境基于16SrDNA分子序列分析的微生物多樣性研究、可培養(yǎng)微生物的現(xiàn)場(chǎng)分離和純化，并選擇1-2個(gè)沉積層較厚、微生物數(shù)量和組成垂直分布差異顯著的沉積樣品進(jìn)行全基因組DNA提取，結(jié)合長(zhǎng)城站實(shí)驗(yàn)室的條件和國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室的后續(xù)分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)微生物多樣性分析及構(gòu)建宏基因組文庫(kù)?，F(xiàn)場(chǎng)分離培養(yǎng)的純株分別按4℃和-80（2）鳥類棲息地/植被/土壤環(huán)境微生物資源與多樣性調(diào)查采集喬治王島地區(qū)具有典型生境特征的鳥類棲息地/植被/土壤等環(huán)境樣品，采用非培養(yǎng)方法（culture-independent）開展微生物多樣性研究，同時(shí)采用多套培養(yǎng)基組合分離其中的可培養(yǎng)菌株，分別按4℃和-80℃保藏，運(yùn)回國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室后將按照微生物菌株資源技術(shù)規(guī)范進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化整理，納入科技部基礎(chǔ)平臺(tái)條件計(jì)劃的國(guó)家E平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)。（3）潮間帶和近海海洋沉積環(huán)境微生物資源與多樣性調(diào)查采集潮間帶和近海海洋沉積物樣品，結(jié)合非培養(yǎng)技術(shù)和可培養(yǎng)技術(shù)獲得春培養(yǎng)菌株和多樣性分析信息，保藏和標(biāo)準(zhǔn)化操作同前。（4）海洋生物共附生微生物資源調(diào)查海洋生物共附生微生物具有生物種間協(xié)同或拮抗的相互作用機(jī)制，是生物個(gè)體和群落間化學(xué)信號(hào)和代謝相互作用的紐帶，具有獨(dú)特的代謝產(chǎn)物多樣性特征及活性先導(dǎo)化合物的發(fā)展?jié)摿?。本?xiàng)目將采集海域中重要海洋動(dòng)物（如貝類、腔腸動(dòng)物、海綿動(dòng)物等）和植物（如囊藻等定生藻類和浮游藻類）樣品，結(jié)合可培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)開展共附生微生物的分離和分子多樣性調(diào)查，菌株和提取的DNA樣品的保藏及其后續(xù)操作同前。（5）喬治王島地區(qū)低溫微生物及其產(chǎn)物資源功能評(píng)價(jià)的前期樣品制備分階段對(duì)分離的純株進(jìn)行初步搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液初提物經(jīng)超低溫或冷凍干粉制備保藏，帶回國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室后將分批開展活性篩選和分析，重點(diǎn)針對(duì)水解酶類和裂合酶類的新型酶制劑的篩選研究，以及針對(duì)以抗菌、重大疾?。ㄌ貏e是糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和惡性腫瘤等）為目標(biāo)的藥物先導(dǎo)化合物的系統(tǒng)活性篩選研究，了解該地區(qū)特殊環(huán)境微生物的次生產(chǎn)物多樣性及其活性功能，后續(xù)在國(guó)內(nèi)繼續(xù)開展藥源微生物及其活性先導(dǎo)物的功能評(píng)價(jià)。.方法和手段主要野外采樣設(shè)備：全部由極地中心備帶，主要包括：湖相沉積專用柱狀采樣器、小型重力管采樣器、MARKII冰芯鉆、汽機(jī)油動(dòng)力JIFFY冰鉆、采水器、小型底拖網(wǎng)具等利用湖相沉積專用柱狀采樣器和/或小型重力采樣器夏季使用特制的湖泊采樣作業(yè)平臺(tái)/冬季以冰鉆開孔后采集湖相沉積柱樣品，現(xiàn)場(chǎng)快速分樣并無菌包裝帶回站。利用小型重力采樣器和/或小型抓斗采集長(zhǎng)城站臨近水域的淺海和潮間帶沉積物樣品，現(xiàn)場(chǎng)快速分樣并無菌包裝帶回站；利用采水器采集近岸海水和湖水樣品，以預(yù)先滅菌的樣品瓶分裝帶回站處理；利用插管方法采集鳥類棲息地/凍土/植被下土壤樣品，現(xiàn)場(chǎng)分裝帶回實(shí)驗(yàn)室；利用小型底托網(wǎng)具采集潮間帶和淺海底棲動(dòng)植物樣品，以預(yù)先滅菌的樣品瓶或袋裝容器分裝帶回站處理；在長(zhǎng)城站實(shí)驗(yàn)室利用若干組合培養(yǎng)基和無菌操作設(shè)備開展上述樣品的分離培養(yǎng)和純化操作；全基因組DNA樣品由預(yù)先準(zhǔn)備的制劑盒按規(guī)程操作提取，樣品4℃冷藏或-80℃超低溫保藏；樣品的細(xì)菌多樣性信息將通過后續(xù)的長(zhǎng)城站實(shí)驗(yàn)室裝備：根據(jù)十五能力建設(shè)項(xiàng)目的建設(shè)計(jì)劃，26次對(duì)將長(zhǎng)城站實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能設(shè)備進(jìn)行全面的安裝調(diào)試和運(yùn)行，主要包括：：實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)架結(jié)構(gòu)件的安裝、低溫生物培養(yǎng)室的安裝調(diào)試和運(yùn)行、無菌操作設(shè)備/低溫超低溫保藏設(shè)備/培養(yǎng)設(shè)備/顯微觀察設(shè)備/基礎(chǔ)光譜設(shè)備/定量稱量和樣品處理制備設(shè)備/監(jiān)測(cè)配套設(shè)備/部分采樣器械等的安裝調(diào)試和運(yùn)行。其它配套設(shè)備：本項(xiàng)目將在上述功能設(shè)備配置的基礎(chǔ)上，根據(jù)本項(xiàng)目越冬調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室處理分析的工作需要進(jìn)一步配備有關(guān)的功能設(shè)備/樣品處理設(shè)備/試劑/野外專用采樣設(shè)備，以實(shí)現(xiàn)全面配套和分析操作。工作計(jì)劃夏季計(jì)劃：2009年12月-2010年2月，根據(jù)長(zhǎng)城站實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)備的安裝調(diào)試工程情況靈活安排附近的野外作業(yè)：完成1-2個(gè)湖泊的湖水和沉積柱狀樣品的采集、分樣和全基因組DNA的提取樣品的制備；開展長(zhǎng)城站臨近地區(qū)的鳥類棲息地、植被土壤、潮間帶、近岸海洋沉積環(huán)境和海洋生物共附生樣品的初步采集，在長(zhǎng)城站實(shí)驗(yàn)室開展可培養(yǎng)和非培養(yǎng)操作，初步分離菌株樣品和制備樣品隨雪龍船運(yùn)回國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室，以便后續(xù)分析。冬季計(jì)劃：2010年3-6月根據(jù)氣象條件分步開展附近湖泊、植被、近岸海域的進(jìn)一步樣品采集；根據(jù)不同樣品類別進(jìn)行處理，使用原位水樣制備組合培養(yǎng)基，對(duì)采獲的樣品及時(shí)開展菌株的組合分離和純化和保藏操作；開展酶類的初步篩選和分析，為連接國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室的后續(xù)分析做好樣品數(shù)據(jù)準(zhǔn)備；使用原位水樣制備組合培養(yǎng)基，開展初步搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，制備樣品初提物并分別按規(guī)范保藏；2010年6-7月，為南極的極夜，野外作業(yè)暫不安排，以持續(xù)的室內(nèi)處理和分析為主；2010年8-10月根據(jù)湖泊結(jié)冰厚度確定湖相沉積物采樣的點(diǎn)位，主要安排離長(zhǎng)城站較遠(yuǎn)端的湖泊樣品的采集；安排鳥類棲息地/潮間帶/近岸海洋沉積環(huán)境/海洋生物共附生樣品的采集和處理，并及時(shí)開展室內(nèi)的處理和分析操作；持續(xù)開展可培養(yǎng)菌株的組合分離和純化操作；持續(xù)開展搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，制備樣品初提物并分別按規(guī)范保藏；整理環(huán)境觀測(cè)數(shù)據(jù)/菌株性狀數(shù)據(jù)/編碼菌株圖像數(shù)據(jù)/初提物編碼數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究分析做好資料準(zhǔn)備；2010年11-12月根據(jù)前期樣品和制備情況補(bǔ)充采樣；持續(xù)實(shí)施非培養(yǎng)和可培養(yǎng)技術(shù)操作；進(jìn)一步整理樣品和數(shù)據(jù)；樣品和設(shè)備包裝階段，做好回國(guó)準(zhǔn)備。后勤支持要求：湖泊作業(yè)的后勤支持：主要是通訊設(shè)備、備用食品、車輛（夏季需用越野車，冬季使用雪地摩托車、雪地車，在可行車路段接送），并可能需要帳篷（3人帳篷2頂及其配套保暖防潮用品），防水防寒連體服裝等；近岸海上作業(yè)主要在夏季開展，需用橡皮艇、通訊設(shè)備、防水連體服裝；根據(jù)采樣位置可能要尋求外國(guó)考察站的合作和支持，具體情況將視站間事先聯(lián)系商議情況在可行的條件下