紫杉醇?xì)ぞ厶亲越M裝納米膠束凍干粉針的制備及理化性質(zhì)評價

紫杉醇?xì)ぞ厶亲越M裝納米膠束凍干粉針的制備及理化性質(zhì)評價

紫杉醇（paclimaxe，ptx）是從蘑菇科植物中提取的天然抗癌藥物。它是從脊柱和胸部中提取的。它主要用于治療卵、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌。由于PTX水中溶解度極低(<6mg·L-1),現(xiàn)用于臨床的紫杉醇制劑多用聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)-乙醇(1∶1)配制的溶液,使用前需要預(yù)先稀釋,此時由于溶劑的轉(zhuǎn)換,PTX易析出沉淀,且所采用的增溶溶媒聚氧乙烯蓖麻油不僅易產(chǎn)生高敏性、神經(jīng)毒性、腎毒性、心臟毒性等不良反應(yīng),而且在給藥過程中能夠溶解靜脈注射輸液管中的增塑劑,即使同時使用氫化可的松,過敏反應(yīng)的發(fā)生率仍達(dá)到10%~30%,大大限制了其臨床應(yīng)用。對不含聚氧乙烯蓖麻油并能顯著提高PTX溶解度的液體制劑的研究成為當(dāng)前的研究熱點,如水溶性PTX前體藥物、環(huán)糊精包合物、脂質(zhì)體、脂肪乳等。納米粒由于其具有靶向給藥、提高藥效、降低藥物毒副作用等優(yōu)點,引起廣大科研工作者矚目。人類一直在追求一種低環(huán)境負(fù)荷、低能耗、低成本的制造高度功能納米粒的方法,自組裝法能很好的滿足這種要求。該法系由兩親高分子材料在水介質(zhì)中發(fā)生微相分離,形成具有疏水性內(nèi)核與親水性外殼的超分子聚集體。該納米膠束不僅可將各種物質(zhì)包裹在其疏水內(nèi)核,且它們的尺寸與典型病毒尺寸相近,加之表面為親水性,使其能夠在血液中長時間循環(huán),并最終穿透腫瘤附近組織被破壞的毛細(xì)血管,而達(dá)到腫瘤靶向治療作用。納米膠束是當(dāng)前藥物遞送系統(tǒng)的研究熱點。本實驗于殼聚糖6位羥基、2位氨基引入羧甲基,2位氨基引入疏水烷基鏈,首次制得兩親性殼聚糖衍生物N-辛基-O,N-羧甲基殼聚糖(N-octyl-O,N-carboxymethylchitosan,OCC)(圖1)。本實驗將考察該兩親性衍生物形成的納米載體對難溶性抗腫瘤藥物紫杉醇的增溶情況,并以市售PTX注射液(paclitaxelinjection,PTX-INJ)為對照,考察其稀釋穩(wěn)定性,并通過動態(tài)光散射、電位測定儀、pH、滲透壓、TEM、DSC和WAXD對載藥納米膠束(paxlitaxel-loadedN-octyl-O,N-carboxymethylchitosan,PTX-OCC)的理化性質(zhì)進(jìn)行研究,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1儀器和藥品1.1冷凍干燥機和高效液相色譜儀VarioELIII元素分析儀;JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);ZNHW型電子節(jié)能控溫儀(鞏義市英峪予華儀器廠);LGJ-10冷凍干燥機(鞏義市英峪予華儀器廠);LC-2010C高效液相色譜儀(日本島津公司);PHS-25B型數(shù)字酸度計(上海大普儀器有限公司);滲透壓摩爾濃度測定儀(天河醫(yī)療儀器有限公司);Zetasizer3000HS激光粒徑測定儀(Malvern,UK);H-7000透射電鏡(日本日立);XD-3A粉末衍射儀(日本理學(xué)Rigaku公司);NETZSCHDSC204差熱掃描分析儀(德國耐馳儀器制造有限公司)。1.2化學(xué)試劑及儀器殼聚糖(玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司,黏均分子量8.71萬,脫乙酰度89.3%);氯乙酸(廣州化學(xué)試劑廠);正辛醛(南京開元嘉禾香精香料有限公司);硼氫化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);紫杉醇注射液(北京協(xié)和制藥廠,批號041008);紫杉醇對照品(中國藥品生物制品檢定所,純度99.06%);紫杉醇(重慶美聯(lián)制藥有限公司,G0411003);甲醇(色譜醇);透析袋(上海綠鳥科技發(fā)展有限公司,MWCO=12000~14000),其他試劑均為分析純。2方法2.1n-烷基-o，n-羧甲基殼聚糖的合成2.1.1o、n-羧甲基貝殼聚糖的合成2.2紫杉醇皮聚糖的制備是一種自制造納米膠束冷凍粉末2.2.1載藥膠束與occ-ptx載藥膠束的制備直接溶解法:稱取OCC51mg,加水50℃攪拌溶脹,加入PTX藥物粉末30mg,于冰浴下探頭超聲10min,重蒸水透析過夜,即得OCC-PTX載藥膠束溶液。乳化溶劑揮發(fā)法:稱取OCC51mg,加水50℃攪拌溶脹,逐滴滴加PTX的二氯甲烷或氯仿溶液(30g·L-1)1mL于載體溶液中,于冰浴下探頭超聲30min,室溫敞口攪拌過夜,0.45μm濾膜過濾,即得OCC-PTX載藥膠束溶液。透析法:稱取OCC51mg,加水50℃攪拌溶脹,逐滴滴加PTX乙醇溶液(30g·L-1)1mL于載體水溶液中,于冰浴下探頭超聲10min,重蒸水透析過夜,0.45μm濾膜過濾,即得OCC-PTX載藥膠束溶液。2.2.2凍干保護(hù)劑的篩選透析法所制得的PTX-OCC溶液中加入一定量的凍干保護(hù)劑,溶解混合均勻,-20℃低溫冰箱放置預(yù)凍24h后,冷凍干燥24h即得凍干粉針。以凍干粉針的外觀和再分散性為考察指標(biāo),篩選凍干保護(hù)劑的種類(甘露醇、乳糖、葡萄糖)及用量。凍干品的外觀需飽滿,無塌陷,表面光潔,色澤均勻,質(zhì)地細(xì)膩;加入一定量5%葡萄糖溶液,輕搖可迅速分散形成均勻的膠束溶液。2.3包封率和載藥量的測定采用RP-HPLC測定膠束溶液紫杉醇含量。色譜條件:色譜柱為LichrospherC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相為甲醇-水(75∶25);流速為1mL·min-1;柱溫:30℃;檢測波長為227nm。精密稱取一定量的PTX-OCC凍干粉末,以5%葡萄糖復(fù)溶,精密量取50μLPTX-OCC溶液于10mL量瓶,甲醇定容至刻度,振搖混勻,測定膠束溶液紫杉醇含量,計算包封率和載藥量。由于紫杉醇水溶性很小(<6mg·L-1),與載入膠束中的紫杉醇量(>2g·L-1)相比可以忽略不計,所以膠束溶液中的游離紫杉醇含量在計算包封率和載藥量時未加考慮。2.4酸液中ptx-occ載藥膠束的制備OCC空白膠束凍干粉末,以5%葡萄糖溶液復(fù)溶稀釋至1g·L-1,PTX-OCC載藥膠束凍干粉末,以5%葡萄糖溶液復(fù)溶稀釋至PTX質(zhì)量濃度為0.5g·L-1,測定其粒徑、ξ電位、pH值及滲透壓理化參數(shù),并與凍干前膠束溶液的理化參數(shù)進(jìn)行比較。2.5磷硅酸染色法取OCC,PTX-OCC膠束凍干粉末適量,以5%葡萄糖溶液充分水合,得淡藍(lán)色乳光膠束溶液,磷鎢酸負(fù)染法染色,即取1滴待測膠束溶液滴于點滴反應(yīng)瓷板的凹槽內(nèi),并將噴碳銅網(wǎng)放于試液上,1~2min后取出銅網(wǎng),用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸去殘余液體;將該銅網(wǎng)放在染液滴(4%磷鎢酸溶液,pH7.0)上約30s,吸干多余染液、干燥,日立H-7000透射電鏡觀察形態(tài)。2.6ptx含量測定稱取一定量的凍干粉末及市售制劑,分別以5%葡萄糖溶液復(fù)溶稀釋至PTX質(zhì)量濃度為0.8g·L-1,于不同時間點取復(fù)溶溶液適量,3000r·min-1離心10min,目測離心管底部有無沉淀,并精密吸取上清液50μL,甲醇稀釋至一定濃度,照“2.2”項下的方法測定PTX含量,并以0h時溶液中PTX含量為100%,計算各時間點膠束溶液或市售制劑稀釋液中PTX的百分含量。2.7dsc分析稱取PTX,OCC,PTX與OCC的物理混合物(34∶66)及PTX-OCC(34.4%)各2~3mg,以10℃·min-1的升溫速率加熱,溫度范圍50~300℃,氮氣氛進(jìn)行DSC分析。2.8粉末x射線衍射稱取PTX,OCC,PTX與OCC的物理混合物(34∶66)及PTX-OCC(34.4%)適量,XD-3A粉末衍射儀進(jìn)行粉末X射線衍射測試。衍射角為5°~40°,掃描速度為1°·min-1,工作電壓為40kV,工作電流為40mA。3結(jié)果與討論3.1紫杉醇聚合物膠束制備工藝的篩選本實驗考察了直接溶解法、乳化溶劑揮發(fā)法、透析法3種工藝對OCC膠束載藥效果的影響,實驗結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明,以載藥量、包封率及膠束粒徑為評價指標(biāo),直接溶解法藥物幾乎沒有載入膠束;乳化溶劑揮發(fā)法是通過溶劑的逐漸揮發(fā)而促進(jìn)膠束的形成及藥物的載入,雖然載藥量和包封率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接溶解法,但載藥量依然不夠理想;以透析法制備的載藥膠束其載藥量和包封率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于直接溶解法和乳化溶劑揮發(fā)法,且膠束粒徑較小。因此,透析法是最佳的載藥方法,OCC納米膠束對PTX均具有極好的載藥能力和包封率,載藥量高達(dá)34.4%的同時,包封率高達(dá)89.3%,這種同時獲得高包封率和高載藥量的紫杉醇聚合物膠束制劑少見報道(最高報道約20%)。一般認(rèn)為,藥物分子和膠束疏水內(nèi)核的相容性是影響膠束對藥物增溶的主要因素,相容性越好,載藥量越高。OCC對PTX的強增溶能力可能是由于PTX對疏水烷基鏈有強大的親合力所致。以凍干品的外觀及凍干品的再分散性為指標(biāo),考察聚合物膠束的凍干處方和工藝。結(jié)果見表2。不加凍干保護(hù)劑的PTX-OCC呈棉花狀,加入5%葡萄糖溶液輕輕振搖即溶解為淡藍(lán)色乳光膠束溶液。加入凍干保護(hù)劑后,凍干品皆呈現(xiàn)為白色餅狀,表面不塌陷,不皺縮,色澤均一。以葡萄糖為凍干保護(hù)劑的凍干粉針粉末較為黏稠,而以乳糖為凍干保護(hù)劑的凍干粉末顆粒較大較硬,復(fù)溶皆較為困難,需渦旋5min才能得到均一的膠束水溶液;以甘露醇為凍干保護(hù)劑制備的凍干粉末則比較疏松,加入5%葡萄糖溶液稍加振搖1min即可得到淡藍(lán)色乳光膠束溶液。為降低處方中甘露醇用量,進(jìn)一步考察加入不同量甘露醇對凍干粉針質(zhì)量的影響,結(jié)果顯示,甘露醇加入量分別為50,30,15g·L-1時,凍干品外觀、復(fù)溶均無明顯差別。因此,最終處方以15g·L-1甘露醇作為凍干保護(hù)劑。3.2膠束理化性質(zhì)的變化納米溶液粒徑大小、ξ電位不僅影響納米溶液的穩(wěn)定性,甚至影響其在體內(nèi)的組織分布和代謝動力學(xué)過程,藥典對大輸液的pH值及滲透壓都有嚴(yán)格的規(guī)定,因此測定以上指標(biāo)對于膠束的質(zhì)量控制有重要意義?？瞻啄z束及載藥膠束凍干前溶液及凍干后復(fù)溶溶液的粒徑及其多分散系數(shù)、ξ電位、pH值和滲透壓值見表3。從表3可看出,凍干前后,膠束粒徑、ξ電位、pH值、滲透壓皆無顯著變化(P>0.05),說明凍干工藝對膠束的理化性質(zhì)無顯著影響。與空白膠束相比,載藥膠束粒徑略有增加,可能大量疏水性藥物增溶至膠束疏水內(nèi)核所致。多分散系數(shù)較小,表明粒徑分布均勻。OCC膠束ξ電位均為負(fù)值,這是由于OCC在殼聚糖骨架上引入了大量的羧甲基,形成膠束后,由于羧甲基的親水性而主要分布在膠束表面,而使OCC膠束表面帶有大量的負(fù)電荷,空白膠束ξ電位在-30mV左右,而載藥后ξ電位增加到-50mV左右,可能是由于大量疏水性藥物的增溶改變了納米膠束表面的電荷分布。一般而言,當(dāng)ξ電位的絕對值>30mV時,由于納米膠束表面存在大量電荷,納米膠束間存在較大的排斥力,而有利于納米溶液的穩(wěn)定并促使納米膠束粒徑大小均一。OCC空白和載藥膠束ξ電勢絕對值均在30mV附近或大于30mV,預(yù)示兩者均具有良好的物理穩(wěn)定性。OCC空白膠束和載藥膠束溶液pH7.2~7.4之間,滲透壓300~320mOsm·kg-1之間,均符合人體靜脈給藥要求。3.3合物膠束的粒徑PTX-OCC膠束的透射電鏡圖見圖2。可以看出,空白殼聚糖聚合物膠束和載藥殼聚糖聚合物膠束皆為規(guī)則球形結(jié)構(gòu),粒徑分布均勻,無論是空白膠束還是載藥膠束,其粒徑均在100nm左右,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于動態(tài)光散射實驗所得到的空白膠束和載藥膠束在溶液中的粒徑,即160~180nm。這可能是由于TEM樣品制備過程中的干燥過程引起膠束表面的塌陷所致。3.4ptx-occ與其他制劑的穩(wěn)定性由于市售制劑臨床使用前需稀釋至0.3~1.2g·L-1,所以載藥殼聚糖膠束凍干粉末復(fù)溶溶液的稀釋穩(wěn)定性至關(guān)重要。本實驗以5%葡萄糖溶液為稀釋介質(zhì),考察了PTX-OCC藥物質(zhì)量濃度為0.8g·L-1時于25℃時的穩(wěn)定性,并與市售制劑進(jìn)行比較,結(jié)果見圖3。PTX-OCC凍干品復(fù)溶溶液穩(wěn)定長達(dá)9d,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于市售制劑,而經(jīng)典的嵌段聚合物膠束對PTX增容后其穩(wěn)定時間一般不超過24h。3.5藥物的熔點和空白膠束的物理混合物差示掃描量熱法(differentialscanningcalorimetry,DSC)是在程序控溫下測量輸入到試樣和參比樣品的功率差與溫度關(guān)系的一種技術(shù)。晶體熔融時要吸收能量(J)以破壞晶格,吸收能量的多少與晶體結(jié)構(gòu)有關(guān),分子特定晶型的特征常數(shù)熱焓(ΔH,單位J·g-1)可表征其晶型特征。PTX、OCC空白膠束、PTX與OCC空白膠束的物理混合物及PTX-OCC載藥膠束的DSC圖譜見圖4。由圖4a可知藥物的熔點為218.0℃,在藥物和空白膠束的物理混合物中藥物的熔點略有降低,為209.7℃(圖4c),而空白膠束和載藥膠束在200~300℃間無峰。圖譜數(shù)據(jù)表明,藥物可能以無定型或固態(tài)溶液的形式存在于膠束骨架中。3.6膠束的wxd實驗根據(jù)廣角X射線衍射(wideangleX-raydiffraction,WAXD)原理,衍射峰的峰形主要與晶體的不完整性和晶體結(jié)構(gòu)有關(guān),即晶粒尺寸的大小、晶體中的缺陷和畸變等。根據(jù)謝樂公式(ScherrerEquation),儀器條件一定的情況下,晶體的晶粒尺寸與衍射峰的平方根成反比,即越寬的衍射峰對應(yīng)試樣的晶粒尺寸越小,而試樣的晶粒尺寸的大小反映其結(jié)晶度高低,較小的晶粒尺寸對應(yīng)較低的結(jié)晶度。PTX,OCC空白膠束,PTX與OCC空白膠束的物理混合物及PTX-OCC載藥膠束的WAXD圖見圖5。從圖5可以看出,PTX在5.28°,8.84°和12.36°處有3個強吸收峰,在15°~25°間有若干弱峰。OCC空白膠束在14.54°,18.72°,20.38°,21.06°,23.36°處有5個強峰,在25°~40°間有若干弱峰。OCC和PTX物理混合物圖譜既有PTX的3個強特征吸收峰,又有空白膠束OCC的5個強特征