電針不同干預(yù)方法對(duì)制動(dòng)致膝關(guān)節(jié)損傷的作用

電針不同干預(yù)方法對(duì)制動(dòng)致膝關(guān)節(jié)損傷的作用

骨關(guān)節(jié)炎是臨床上常見(jiàn)的疾病。其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)周圍軟組織損傷，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷，最終影響整個(gè)關(guān)節(jié)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨、纖維、斷裂、潰瘍和整個(gè)關(guān)節(jié)面的損傷。膝骨關(guān)節(jié)炎以膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和肌肉運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要臨床表現(xiàn),其中股四頭肌肌力減弱是膝骨關(guān)節(jié)炎肌肉功能障礙的一個(gè)特征性表現(xiàn)。臨床研究發(fā)現(xiàn),針刀、電針和圓利針均能有效改善膝骨關(guān)節(jié)炎功能障礙;實(shí)驗(yàn)研究表明,針刀、電針等治療膝骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制與細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)因子、自由基、軟骨細(xì)胞凋亡與代謝、蛋白酶及抑制劑等有關(guān)。近幾年針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究有一定的進(jìn)展,一些研究結(jié)果表明,針刀療法可降低實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎兔軟骨細(xì)胞和膠原纖維的破壞程度,對(duì)其中樞水平的β-內(nèi)啡肽及血清炎性細(xì)胞因子有良性調(diào)節(jié)作用;電針可提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛閾,具有良好的外周鎮(zhèn)痛作用。但相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中,觀察針刺、電針、艾灸對(duì)肌肉韌帶等軟組織影響的研究不足,且對(duì)于具體針?lè)?、不同針具以及電針刺激參?shù)報(bào)道較少。本研究旨在觀察不同干預(yù)方法對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔股直肌細(xì)胞凋亡的影響。1材料和方法1.1動(dòng)物的個(gè)體實(shí)驗(yàn)和人工養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康新西蘭大白兔45只,體質(zhì)量2.0~2.5kg,由北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(京)2013-0022。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守國(guó)家科技部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。動(dòng)物自由飲水和攝食,光照與黑暗為12h交替,室溫為20~22℃。按隨機(jī)原則將動(dòng)物分為正常組、模型組、針刀組、電針組、圓利針組,每組9只,其中每組1只用于造模成功的病理檢測(cè),每組8只用于其它指標(biāo)檢測(cè)。1.2針、針、儀器B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)一抗兔多克隆抗體(美國(guó)abcam公司);Bcl-2相關(guān)的X蛋白(Bax)一抗兔多克隆抗體(瑞士Enzolife公司);天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)一抗兔多克隆抗體(美國(guó)abcam公司);二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。漢章牌一次性針刀,規(guī)格:0.40mm×40mm,刃寬0.4mm(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司);樂(lè)灸牌一次性圓利針(端為針尖無(wú)刀刃),規(guī)格:0.4mm×40mm(馬鞍山邦德醫(yī)療器械有限公司);一次性無(wú)菌針灸針,規(guī)格:0.25mm×25mm(環(huán)球牌,蘇州針灸用品有限公司);HANS穴位神經(jīng)刺激儀,型號(hào):LH202H(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀、BINTA數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad);4℃低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo);常溫高速離心機(jī)、微量加樣器(德國(guó)Eppendorf);電子天平(德國(guó)Sartouris);紫外分光光度計(jì)(德國(guó)Bio-photometer);恒溫金屬浴(北京中西遠(yuǎn)大);免疫印跡檢測(cè)圖像分析儀(美國(guó)MediaCybernetics公司);關(guān)節(jié)測(cè)量?jī)x(F-JDC,上海欣曼科教設(shè)備有限公司)。1.3石膏韌帶的固定采用改良后的Videman左后肢伸直位固定制動(dòng)法。造模前動(dòng)物禁食10~16h,以3%戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉。剪去左后肢踝關(guān)節(jié)以上兔毛,牽拉使其處于完全伸直位,速干型石膏繃帶經(jīng)65~85℃熱水浸泡軟化后,從腹股溝到趾頭固定(膝關(guān)節(jié)伸直180°,踝關(guān)節(jié)背屈60°),留出足趾觀察血供,石膏繃帶外用彈力醫(yī)用繃帶固定防止兔撕咬,共制動(dòng)4周。如足趾有壞死傾向,立刻拆除石膏繃帶,待腫脹消退后再重新固定。若石膏繃帶松動(dòng)或脫落及時(shí)重新固定。造模4周后,各組動(dòng)物隨機(jī)抽取1只處死,取關(guān)節(jié)軟骨作病理觀察,可見(jiàn)病變關(guān)節(jié)軟骨淺表區(qū)粗糙或有炎性腫脹,產(chǎn)生裂隙,深達(dá)輻射區(qū),深層細(xì)胞數(shù)目異常,表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目減少或簇聚,示造模成功,將所有動(dòng)物的石膏固定拆除。1.4電針刺激治療組正常組:正常飼養(yǎng)。模型組:造模后正常飼養(yǎng)。電針組:造模后4周起,電針兔左側(cè)“陽(yáng)陵泉”-“陰陵泉”“內(nèi)膝眼”-“外膝眼”。取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》,并結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法,根據(jù)比較解剖取穴法結(jié)合模擬骨度取穴法,選取膝關(guān)節(jié)上述腧穴進(jìn)行治療。以HANS穴位神經(jīng)刺激儀行電針刺激治療,分別連接“陽(yáng)陵泉”和“陰陵泉”,“內(nèi)膝眼”和“外膝眼”。疏密波,頻率2Hz/100Hz,強(qiáng)度3mA,每次20min,隔日治療1次,1周3次,共3周。針刀組:造模后4周起,兔膝關(guān)節(jié)左側(cè)針刀進(jìn)針部位,以龍膽紫定位,常規(guī)備皮、消毒。①內(nèi)、外側(cè)副韌帶進(jìn)針點(diǎn)操作:針刀于韌帶中點(diǎn)前緣進(jìn)針,刀口線與韌帶方向平行,刀體與皮膚切面垂直刺入,向韌帶起、止點(diǎn)方向分別松解5次,出刀并加壓片刻;②髕韌帶進(jìn)針點(diǎn)操作:刀口線與髕韌帶縱軸平行,刀體和髕韌帶皮膚切面垂直,快速刺入達(dá)髕韌帶下,由上而下松解5次,出刀并加壓片刻。每周1次,共3次。圓利針組:造模后4周起,常規(guī)備皮、消毒,進(jìn)針點(diǎn)與針刀組相同,松解5次。每周1次,共3次。1.5兔7db蛋白的檢測(cè)各組兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)范圍(PROM)測(cè)量:分別于造模4、8和12周使用康復(fù)功能評(píng)定關(guān)節(jié)測(cè)量?jī)x(F-JDC)測(cè)量各組兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)PROM。測(cè)量時(shí),將量角器軸心對(duì)準(zhǔn)股骨外側(cè)髁,固定臂與股骨長(zhǎng)軸平行,移動(dòng)臂與脛骨平行,當(dāng)關(guān)節(jié)屈曲或伸展時(shí),移動(dòng)臂隨脛骨運(yùn)動(dòng)而運(yùn)動(dòng),當(dāng)膝關(guān)節(jié)屈曲到最大位時(shí),讀出屈曲度數(shù),當(dāng)伸直到最大位時(shí),讀出伸直度數(shù),二者差值即為膝關(guān)節(jié)PROM。蛋白免疫印跡(Westernblot)法檢測(cè)兔左側(cè)股直肌Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平:所有干預(yù)結(jié)束1周后,用空氣栓塞法處死動(dòng)物,迅速取兔髕骨上方股直肌2cm×2cm×2cm,立即將標(biāo)本置于塑料試管內(nèi),封蓋,-80℃冷凍,用于Westernblot檢測(cè)。細(xì)胞裂解法提取兔股直肌組織總蛋白,加細(xì)胞裂解液至冰上30min后粉碎細(xì)胞,離心10min(4℃10000r/min),收集上清,-80℃保存。BCA法測(cè)蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度取等量蛋白,加5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS)上樣緩沖液煮沸5min,進(jìn)行SDS電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用含70g/L脫脂奶粉的含0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)封閉液置搖床上封閉2h,經(jīng)1×TBST充分漂洗(5min×3次),分別加兔抗鼠Bax多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體(稀釋度為1∶1000),4℃搖床過(guò)夜,充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀釋度為1∶1000),室溫?fù)u床上孵育2h,充分漂洗,化學(xué)發(fā)光法顯色。用GAPDH做內(nèi)參重復(fù)以上步驟。采用Image-ProPlus6.0軟件分析圖像,以Bcl-2/GAPDH、Bax/GAPDH、Caspase-3/GAPDH比值分別表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。1.6準(zhǔn)差ue0afs使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,樣本均數(shù)間的兩兩比較用LSD檢驗(yàn),同組同側(cè)自身前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1各組兔左、雙側(cè)膝關(guān)節(jié)prom變化比較各組兔右側(cè)(未造模側(cè))膝關(guān)節(jié)PROM在同一時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);同一組別各時(shí)間點(diǎn)比較,針刀組、圓利針組造模12周右側(cè)膝關(guān)節(jié)PROM較造模4、8周下降(P<0.01,P<0.05)。造模4、8周,與正常組比較,模型組、針刀組、電針組和圓利針組兔左側(cè)(患側(cè))膝關(guān)節(jié)PROM均明顯降低(P<0.01),模型組與各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);造模12周,與正常組相比,模型組左側(cè)膝關(guān)節(jié)PROM明顯降低(P<0.01),與模型組相比,針刀組、電針組和圓利針組左側(cè)膝關(guān)節(jié)PROM顯著升高(P<0.01),各治療組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);同一組別各時(shí)間點(diǎn)比較,造模8周時(shí)電針組左側(cè)膝關(guān)節(jié)PROM較4周時(shí)明顯升高(P<0.01),造模12周時(shí)模型組、針刀組、電針組和圓利針組左側(cè)膝關(guān)節(jié)PROM較4、8周時(shí)均顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖1、圖2。2.2血壓bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)各組股直肌Bcl-2蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組股直肌Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)較正常組顯著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05);與模型組比較,針刀組與圓利針組Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05);針刀組與圓利針組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針組上述各指標(biāo)的變化與模型組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。3細(xì)胞凋亡caspase膝骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)屬于“痹癥”范疇,是外邪留于肌膚筋肉之間,致氣血不通,而出現(xiàn)筋肉酸楚、疼痛、麻木、拘攣、活動(dòng)受限等臨床表現(xiàn),其病因?yàn)轱L(fēng)寒濕等外邪侵襲皮肉筋骨,致筋脈氣血失和,閉阻不通,屬于經(jīng)筋病。在治療上,《靈樞·經(jīng)筋》提出“治在燔針劫刺,以知為數(shù),以痛為輸”的原則,《素問(wèn)·痿論篇》提出“宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)也”。而針刀、圓利針則是通過(guò)松解病變關(guān)節(jié)周圍的肌肉、肌腱及韌帶等軟組織(即筋肉),達(dá)到調(diào)筋治骨的目的。電針選取“陰陵泉”-“陽(yáng)陵泉”“內(nèi)膝眼”-“外膝眼”穴,陽(yáng)陵泉為足少陽(yáng)膽經(jīng)之合穴,八會(huì)穴之“筋會(huì)”,可主治筋攣急、不仁,筋軟,筋疼等,陰陵泉為足太陰脾經(jīng)之合穴,可主治肌痹、膝痛,內(nèi)、外膝眼兩穴則為局部取穴之意?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的病因尚未完全明確,以骨骼肌為代表的軟組織損傷發(fā)生于膝骨關(guān)節(jié)炎病變的早期,尤其是制動(dòng)固定兔膝關(guān)節(jié)模型。關(guān)節(jié)制動(dòng)10~14d后關(guān)節(jié)四周肌肉即開(kāi)始萎縮,肌腹進(jìn)行性變細(xì),部分肌纖維變性攣縮;制動(dòng)60d后,充血水腫逐漸減退,開(kāi)始出現(xiàn)纖維變性和攣縮,部分關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)軟骨和滑膜淀粉樣變,焦磷酸二氫鈣局灶性沉積,關(guān)節(jié)穩(wěn)定性減弱。盡管膝骨關(guān)節(jié)炎破壞的終端在軟骨和骨組織,但是機(jī)械應(yīng)力來(lái)自關(guān)節(jié)周圍軟組織的攣縮,其發(fā)生與過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷直接作用和營(yíng)養(yǎng)障礙的間接作用高度相關(guān),因此研究關(guān)節(jié)周圍的肌肉等軟組織的損傷與修復(fù)是治療干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎最有前景的對(duì)策。細(xì)胞凋亡發(fā)生在許多生理和病理過(guò)程中,是一個(gè)受嚴(yán)格調(diào)控的能量依賴性的自殺程序,其控制了細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)式放大導(dǎo)致細(xì)胞死亡卻不啟動(dòng)炎性反應(yīng)。Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素,Bcl-2和Bcl-x1有抗凋亡作用,Bax、Bad和Bak有促凋亡作用,尤其是Bcl-2/Bax比率是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開(kāi)關(guān)”,它在決定細(xì)胞凋亡的易感性中起關(guān)鍵作用。一般而言,Bcl-2的過(guò)度表達(dá)與Bax形成異二聚體而阻抑凋亡。當(dāng)一細(xì)胞系的所有細(xì)胞內(nèi)異二聚體(Bcl-x1/Bax和Bcl-2/Bax)的含量≥50%時(shí),細(xì)胞耐受凋亡;而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax同二聚體>80%時(shí)且在適當(dāng)信號(hào)誘導(dǎo)下則細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。而Caspase不僅僅是凋亡現(xiàn)象中的一種重要效應(yīng)作用分子,還被認(rèn)為是這一家族中的關(guān)鍵蛋白酶。Caspase-8參與凋亡執(zhí)行,并誘導(dǎo)Caspase-3激活,啟動(dòng)類Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),然后活化執(zhí)行類Caspase裂解特異性底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究表明降低Caspase-3的激活可以有效抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,造模措施造成了單側(cè)膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能障礙且模型穩(wěn)定的時(shí)間窗是造模4周。在針刀、電針和圓利針各干預(yù)治療組兔膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能障礙改善明顯優(yōu)于模型組自然修復(fù)的程度,但對(duì)側(cè)肢體存在一定程度的代償性功能下降。本研究中兔股直肌Bcl-2蛋白表達(dá)的變化與一些學(xué)者研究結(jié)果相似;針刀和圓利針通過(guò)下調(diào)股直肌中Bax和Caspase-3蛋白表達(dá),提高Bcl-2/Bax比值,從而干預(yù)細(xì)胞凋亡。季傳婷等研究